CD137信号通过Smad1/5-NFATc1信号调控血管新生

作     者：翁嘉懿 

作者单位：江苏大学 

学位级别：硕士

导师姓名：严金川

授予年度：2016年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：CD137 Smad1/5 NFATc1 血管新生 动脉粥样硬化 

摘      要：目的CD137信号是否通过Smad1/5调节活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells,NFATc1)信号调控血管新生。方法1.小鼠动脉粥样硬化模型:使用载脂蛋白E基因敲除(Apo E)-/-小鼠建立小鼠动脉粥样硬化模型。2.马松染色与免疫组化染色:分别使用马松及免疫组化染色方法观察干预CD137轴后斑块变化(斑块面积,组成,NFATc1,CD31,CD68)。3.流式细胞术(Flow Cytomery,FCM):流式细胞术检测内皮细胞内CD137膜蛋白表达水平。*** blot技术:检测p-Smad1/5,Smad1/5总蛋白,NFATc1核蛋白及总蛋白表达水平。细胞免疫荧光法检测NFATc1在内皮细胞细胞核内外分布。5.增殖和迁移实验:CCK8检测检测内皮细胞增殖情况,Transwell迁移实验检测内皮细胞迁移能力。6.体内外血管新生模型:人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)管腔形成实验,小鼠主动脉环血管新生实验,体内基质胶塞实验分别作为体外,离体,体内血管新生模型检测CD137对血管新生的影响。7.分子生物学方法:转染Smad1/5小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA)干扰Smad1/5基因表达。构建沉默NFATc1基因及其对照的慢病毒载体,慢病毒包装,感染细胞,筛选细胞系,分别命名为PLKO.1-sh NFATc1和PLKO.1-sh GFP。结果***137可诱导ApoE小鼠动脉粥样硬化斑块内NFATc1及CD31表达。2.肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)(10ng/ml)刺激HUVEC和小鼠脑微血管EC 24h后,CD137膜蛋白表达增加。***137促进体内外血管新生:内皮细胞功能实验中,我们观察到,相较对照组而言,在添加刺激性CD137抗体(CD137 m Ab,5mg/L)条件下,小鼠内皮细胞增殖和迁移能力增强(p均0.05),而CD137阻断性抗体(anti-CD137,5mg/L)可阻断该现象。同时,CD137刺激条件下,体外HUVEC管腔形成实验显示,小管总长度及分支点数目显著增加(p均0.05);离体主动脉环血管新生实验显示,动脉环微血管数目显著增加(p均0.05);而在基质胶塞实验中,可观察到单独CD137刺激条件下,虽然未观察到明显血管新生现象,但CD137可增强VEGF诱导的血管新生作用(胶内红色表示红细胞),血红蛋白含量明显增加(p0.05)。在三种血管新生模型中,CD137所诱导的促进作用均可被anti-CD137所抑制。***137激活内皮细胞Smad1/5蛋白及上调NFATc1蛋白表达并转位入核:CD137抗体刺激内皮细胞后,细胞内磷酸化Smad1/5(p-Smad1/5)蛋白及NFATc1蛋白表达呈时间依赖性升高,分别于1h及12h时表达水平达到峰值,与对照组相比差异显著,且这种活化作用可被抑制性CD137抗体所阻断(p均0.05)。激活内皮细胞内CD137信号,细胞核内NFATc1蛋白表达水平升高(p0.05),与western blot检测结果一致,免疫荧光实验显示:与对照组相比,添加CD137抗体不仅可增加NFATc1蛋白表达,并促进NFATc1进入细胞核,同时添加抑制性CD137抗体可逆转该现象。***1/5 si RNA可减弱CD137诱导内皮细胞表达NFATc1及促进体外血管新生的效应:转染Smad1/5 si RNA沉默Smad1/5基因表达后,再添加刺激性CD137抗体刺激内皮细胞显示,p-Smad1/5活化受到抑制,不仅NFATc1总蛋白及核蛋白表达水平下降(p均0.05),而且HUVEC管腔实验及动脉环血管新生实验发现,与对照组相比,小管长度及分支显著减少,动脉环内微血管形成数量减少(p均0.05)。6.沉默NFATc1基因可减弱体外CD137诱导血管新生效应:HUVEC管腔形成实验中,添加CD137刺激后,相较对照细胞系PLKO.1-sh GFP,沉默NFATc1的内皮细胞系PLKO.1-sh NFATc1小管长度及分支点显著减少(p均0.05)。在离体主动脉环血管新生实验中,沉默NFATc1基因后,添加CD137刺激,小鼠主动脉环形成的微血管数量较对照组明显减少(p0.05)。结论***-α能刺激内皮细胞表达CD137蛋白;***137信号激活可上调斑块内NFATc1表达,促进斑块内血管新生,影响不稳定斑块形成;***137信号能够上调内皮细胞p-Smad1/5表达水平,从而影响NFATc1表达。***137信号激活