钝顶螺旋藻藻蓝蛋白与多糖的制备及生物活性研究

作     者：朱孝晨 

作者单位：烟台大学 

学位级别：硕士

导师姓名：孙利芹

授予年度：2018年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：钝顶螺旋藻 多糖 藻蓝蛋白 抗疲劳效果 降血糖效果 

摘      要：螺旋藻为一种多细胞、纤维状的蓝藻,在医药保健、食品等方面具有广泛的应用。目前有关螺旋藻的应用主要以出售螺旋藻藻粉、胶囊、片剂等为主,难以实现产品高附加值利用。本文以钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)为原材料,分别制备了不同分子量的螺旋多糖(PSP)和不同纯度的藻蓝蛋白(C-PC),同时采用体内、外活性实验研究了C-PC和PSP对应的抗疲劳、降血糖活性。具体研究内容和结果如下:(1)螺旋藻多糖的分级制备及活性研究:脱蛋白后的螺旋藻多糖(PSP1),采用HO-Vc体系结合超滤法降解得到两种分子量多糖PSP2和PSP3,理化性质测定表明降解后多糖的溶解性、硫酸基含量增加,红外光谱分析多糖结构没有发生变化。体外抗氧化活性以及抑制α-葡萄糖苷酶活性实验显示,随着多糖分子量的降低,其抗氧化活性和抑制α-葡萄糖苷酶活性明显加强,PSP3活性最好。(2)螺旋藻藻蓝蛋白的分离纯化:反复冻融破壁后得到纯度(A/A)为0.56的C-PC;然后分别采用盐析法、双水相萃取法以及盐析结合双水相萃取法制备三种不同纯度的藻蓝蛋白C-PC、C-PC和C-PC。盐析法最佳硫酸铵饱和度为40%,盐析后得到的C-PCⅡ纯度和回收率分别为1.08、83%;响应面法优化出PEG/KHP双水相萃取体系最佳工艺为:聚乙二醇(PEG)质量分数为12.3%(m/m),磷酸盐(KHP,KHPO:KHPO=1:1)质量分数15.1%(m/m),pH为5.9,此工艺条件下所得C-PC的纯度及回收率分别为2.33和79%;盐析结合双水相萃取法得到的C-PC纯度最高,其对应的纯度和回收率分别为3.47、63%。(3)藻蓝蛋白的抗疲劳活性评价:小鼠力竭游泳实验表明表明,不同纯度的C-PC均能提高小鼠的力竭时间。其中,纯度为3.47的C-PCⅣ中剂量组(200 mg/kg)小鼠力竭游泳时间最长,与阳性对照相比提高了82.4%。四种纯度的C-PC均能提高运动后小鼠的乳酸脱氢酶(LDH)、肝糖原(LG)含量,同时降低血乳酸(BLA)、血尿素氮(BUN)含量。同时,常压耐缺氧实验表明C-PC能够提高小鼠的缺氧耐力。综合各项指标分析,藻蓝蛋白纯度越高,抗疲劳效果越好。纯度为3.47的C-PCⅣ抗疲劳效果最好,但与纯度为2.33的C-PC相比没有显著性差异。(4)藻蓝蛋白与多糖的降血糖活性研究:建立体外3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型,研究发现PSP1、PSP2和PSP3三种多糖均能改善3T3-L1脂肪细胞的胰岛素抵抗作用,提高葡萄糖糖摄取能力,低分子量多糖PSP3的作用效果最好。通过腹腔注射链脲佐菌素(STZ)建立小鼠糖尿病模型,灌胃给药PSP3、C-PC以及PSP3/C-PCⅢ复合物(CPM,质量比1:1)连续给药28 d后,检测糖尿病小鼠的空腹血糖值、血脂含量以及氧化应激等指标。结果表明三者均能降低糖尿病小鼠空腹血糖值,与模型组相比,C-PCⅢ200 mg/kg剂量组小鼠体内血糖值降低了60.35%。同时可通过降低糖尿病小鼠血清中胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-c)含量,提高高密度脂蛋白(HDL-c)含量来改善糖尿病引起的小鼠脂质代谢紊乱现象。给药治疗后糖尿病小鼠的胰岛素(FINS)含量升高,胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)下降。检测氧化应激指标发现,灌胃PSP3、C-PCⅢ和CPM治疗后能够降低糖尿病小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和γ-谷氨酰转肽酶(γ-GGT)活性,提高肝脏组织中过氧化氢酶(CAT)、超氧化歧化酶(SOD)以及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性。其中,C-PCⅢ降血糖效果最好。