脂多糖诱导小鼠腹腔巨噬细胞parkin表达及线粒体自噬形成

作     者：程艳伟 

作者单位：安徽医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张林杰;黄保军

授予年度：2014年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100102[医学-免疫学] 10[医学] 

主      题：小鼠腹腔巨噬细胞 脂多糖 parkin 线粒体自噬 

摘      要：背景及目的：炎症反应是生物体在长期进化过程中对内、外源刺激因素建立的一套精密的监视、防御及修复机制。它能控制感染,促进伤口愈合,但过度的炎症反应则可造成组织细胞的损伤。病原微生物及其产物通过模式识别受体导致固有免疫细胞激活和炎症介质释放是炎症发生的主要机制。研究表明,内毒素可通过单核巨噬细胞TLR4信号途径,导致线粒体呼吸链组装蛋白ECSIT的泛素化及线粒体活性氧(mtROS)产生,从而增强巨噬细胞杀菌活性。在巨噬细胞对内毒素应答中,活性氧和炎症条件下的应激反应会伴随线粒体能量代谢发生改变,导致线粒体损伤并释放线粒体组分,进一步放大炎症反应。 自噬是一个受严格调控的细胞内容物降解和再循环过程,参与细胞器代谢、再利用、生物能量补充等。当各种原因导致线粒体损伤,膜电位丧失发生去极化后,损伤的线粒体通过线粒体自噬被降解清除。Parkin介导的线粒体自噬途径在哺乳动物细胞对损伤线粒体的降解中发挥关键作用。但parkin及其介导的线粒体自噬在巨噬细胞对内毒素刺激的应激反应中的作用及机制目前尚不清楚。 本研究拟通过建立小鼠腹腔巨噬细胞内毒素应激模型,观察巨噬细胞在内毒素刺激后parkin表达及线粒体自噬发生情况,为进一步完善炎症反应调控的可能途径提供实验依据。方法：无菌分离并原代培养昆明种小鼠腹腔巨噬细胞,制备内毒素(LPS)应激巨噬细胞模型;筛选合适LPS刺激浓度;JC-1染色标记线粒体,应用流式细胞仪检测巨噬细胞在LPS刺激后线粒体膜电位变化;RT-PCR分别检测LPS作用不同时间的parkin mRNA表达水平;western blot检测parkin蛋白表达水平;应用parkin抗体标记间接免疫荧光法,通过激光共聚焦检测在LPS刺激前后parkin在巨噬细胞内的定位情况;western blot检测巨噬细胞自噬蛋白LC3-Ⅱ及LC3-Ⅰ表达水平,以评估自噬发生程度;制备细胞爬片,应用荧光染料Mitotracker green标记线粒体,分别用抗体标记parkin及LC3进行间接免疫荧光染色,通过激光共聚焦显微镜观察线粒体、parkin与LC3三者之间的共定位关系。 结果：成功制备小鼠腹腔巨噬细胞内毒素应激模型,JC-1染色流式细胞仪检测结果显示：在200ng/ml LPS刺激巨噬细胞后,线粒体膜电位降低,并且随LPS作用时间延长呈持续下降趋势,膜电位正常线粒体由刺激前的92.57%±1.84下降到刺激24h后的74.35±2.01,表明巨噬细胞在LPS刺激后存在线粒体损伤;RT-PCR结果显示parkin mRNA水平在LPS刺激6h内有少量增加的趋势,但western blot结果显示parkin蛋白水平在LPS刺激6h后增加明显,表明LPS刺激在巨噬细胞中可以诱导parkin表达;激光共聚焦显微镜检测结果显示parkin在巨噬细胞未受LPS刺激时在细胞质中呈均匀分布,而LPS刺激后parkin呈明显的点状聚集分布;western blot检测LC3Ⅱ/Ⅰ的结果显示LPS刺激巨噬细胞后,随着时间的增加,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例增大,表明巨噬细胞发生明显的自噬;激光共聚焦显微镜检测结果显示,巨噬细胞在LPS刺激后,parkin、自噬体和线粒体三者存在共定位情况。 结论： 1.巨噬细胞在一定浓度LPS刺激后,发生线粒体损伤,线粒体膜电位下降。 2. parkin在巨噬细胞LPS刺激前均匀分布于细胞质中,LPS刺激后其在蛋白水平增加明显,并呈点状聚集分布。 3.巨噬细胞在LPS刺激后,parkin、自噬体和线粒体三者存在共定位关系,表明parkin介导的线粒体自噬参与了对损伤线粒体的清除,进而可能在巨噬细胞参与的炎症反应中起到一定的调控作用。