锯缘青蟹精氨酸激酶的分离纯化、分子克隆及过敏原性研究

作     者：沈苑 

作者单位：集美大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘光明

授予年度：2010年

学科分类：0908[农学-水产] 09[农学] 

主      题：锯缘青蟹 精氨酸激酶 过敏原 纯化 克隆表达 双向电泳 质谱分析 免疫胶体金层析 

摘      要：食物过敏是人类常见的一种免疫性疾病,随着社会进步和全球化进程的不断发展,食物过敏的发病率越来越高,成为全球关注的食品安全问题。食物过敏主要由食物中蛋白质引起,主要症状有哮喘、荨麻疹等,严重的甚至会危及到生命。水产品是最常见的过敏食物,水产食品中原肌球蛋白、小清蛋白等作为主要过敏原已得到国内外学者的广泛研究,而对于精氨酸激酶(Arginine Kinase,AK)是否为过敏原,其理化特性及致敏性如何,仍有待于进一步的研究证实。 锯缘青蟹(Scylla serrata)肉质鲜美,营养丰富,是我国蟹类增养殖的重要对象,深受我国消费者喜爱,同时其远销日本、东南亚等国家,也是全球的主要经济蟹类。本研究以国内产量丰富的锯缘青蟹为研究对象,从分离纯化、抗体制备、分子克隆、原核表达、过敏原性等方面对精氨酸激酶进行了研究。 首先采用70-90 %硫酸铵沉淀及HiTrap Q亲和层析方法,从锯缘青蟹肌浆蛋白中分离得到分子量为40 kDa的天然蛋白(nAK),SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)及2D-PAGE(Two dimensional-PAGE,2D-PAGE)分析结果显示该蛋白的分子量为40 kDa、等电点为6.5,这与虾类精氨酸激酶Pen m 2性质相近。兔抗白虾精氨酸激酶IgG抗体及兔抗锯缘青蟹精氨酸激酶IgG抗体的Western-blot结果表明纯化的锯缘青蟹40kDa蛋白为精氨酸激酶。 通过分子生物学技术方法,克隆得到锯缘青蟹精氨酸激酶开放阅读框基因序列。测序结果显示,该开放阅读框基因的序列长度为1071 bp,编码356个氨基酸残基,该序列登录Genbank(GQ:851626)。序列比对结果显示,锯缘青蟹精氨酸激酶基因与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)精氨酸激酶基因的序列同源性高达94 %,与岸蟹(Carcinus maenas)、中华绒鳌蟹(Eriocheir sinensis)等甲壳类动物的精氨酸激酶也有较高的同源性(均90 %)。将克隆得到的锯缘青蟹精氨酸激酶基因与pGEX-4T-3载体连接,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导得到分子量为65 kDa的融合表达蛋白(GST-AK)。2D-PAGE分析显示,经凝血酶酶切后的重组蛋白(rAK)分子量为40 kDa、等电点为6.3,与天然的精氨酸激酶相近。精氨酸激酶的体外重组表达成功,也为今后蟹类过敏原的标准化生产提供了技术基础。 进一步通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI TOF-MS)进行肽指纹图谱鉴定,并对鉴定的结果采用Mascot搜索引擎在NCBInr数据库上进行搜索,结果表明纯化的天然蛋白(nAK)与榄绿青蟹(Scylla olivacea)精氨酸激酶匹配分值最高为138,吻合肽段数为为17条,融合表达蛋白(GST-AK)与中国明对虾(Fenneropenaeus merguiensis)的精氨酸激酶匹配分值最高为80,吻合肽段数为为12条,确认纯化的天然蛋白及融合表达的重组蛋白均为精氨酸激酶。 应用甲壳类过敏患者血清的免疫印迹分析,结果显示纯化的天然蛋白及融合表达的重组蛋白具有免疫原性,首次证实精氨酸激酶为锯缘青蟹的特异性过敏原。应用体外重组表达融合蛋白的胶体金免疫试纸条分析,结果表明该融合蛋白可用于甲壳类食物过敏诊断试剂的开发与应用。