人参内生真菌对人参毛状根生长及次生代谢的影响

作     者：陈泠 

作者单位：第二军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：韩婷;秦路平

授予年度：2016年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：人参 内生真菌 毛状根 次生代谢 普通裂褶菌Schizophyllum commune 免疫荧光染色 关键酶 

摘      要：人参(Panax ginseng ***.)是五加科人参属植物,其干燥根和根茎同名入药,始载于《神农本草经》,列为上品,是我国常用传统中药。味甘、微苦,性微温。归肺、脾、心、肾经,具有大补元气,补脾益肺,生津止渴,安神益智等功效。现代临床主要用于治疗心气虚证、冠心病、心律失常等疾病,是应用最广泛、研究最深入的中药之一,主要分布在我国辽宁东部、吉林东部和黑龙江东部。现代研究表明,人参含有人参皂苷、氨基酸及挥发油等成分。其中公认的有效成分主要是人参皂苷,可分为三类:一是五环三萜类的齐墩果烷型皂苷——人参皂苷Ro;二是原人参二醇型的四环三萜类达玛烷型皂苷——人参皂苷Rh2、Rg3、Rb1、Rb、Rc;原人参三醇型的四环三萜类达玛烷型皂苷——Re、Rf、Rg1。利用发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes侵染宿主植物人参Panax ginseng ***.的细胞可以诱导其产生大量的人参毛状根。毛状根与传统的细胞培养技术相比,是更为理想的生产次生代谢产物的植物组织,因为其具有生长周期短、遗传性状稳定以及激素自养型等特点。人参毛状根是一种激素自养型的植物组织培养物,通过调控而改变其次生代谢产物的积累是较有意义的。因此以人参毛状根为平台,为人参皂苷类和人参多糖类次生代谢产物的生产开辟了一种新的途径。本课题以我国重要药用植物人参Panax ginseng ***.和西洋参Panax quinquefolius L.的内生真菌作为研究对象,以人参毛状根为研究平台,筛选得到能够与人参共培养并促进宿主植物生长及有效成分含量积累的内生真菌;通过形态及分子鉴定确定目标菌种的种属;通过高效液相色谱技术研究人参毛状根活性成分的变化;通过免疫荧光染色技术研究人参内生真菌侵染宿主植物的过程;通过RT-RCR技术研究人参皂苷代谢途径中关键酶基因的变化。期望初步探讨人参内生真菌影响人参毛状根的机制,为揭示内生真菌影响中药材品质及其机制提供实验基础和科学依据。主要研究结果如下:1.采用传统分离方法从吉林省通化市栽培3年人参、4年人参、4年西洋参根中分离得到内生真菌83株,根据形态合并为55个形态型;采用HPLC筛选到了一株能够能与人参毛状根共培养,并提高人参毛状根生物量和人参皂苷Rc、人参皂苷Rg2、人参皂苷Rg3含量的内生真菌3R-2,通过形态和分子鉴定为普通裂褶菌(Schizophyllum commune),为下一步研究人参内生真菌对人参毛状根的影响提供了目标菌株。2.将人参内生真菌3R-2菌丝通过打孔的方式加入到人参毛状根培养液中,考察3R-2菌丝对人参毛状根生长和次生代谢成分生物合成的影响。结果表明在3R-2菌丝与人参毛状根共培养的7天内,3R-2菌丝对人参毛状根的生物量、人参皂苷Rg2和人参皂苷Rg3的含量无显著影响,在14-21天内有显著的促进作用;3R-2菌丝与人参毛状根共培养的14天时,人参皂苷Rc的含量达到最高。3.为了去除3R-2菌丝的毒力作用以考察3R-2对人参毛状根的影响,我们将3R-2菌丝的水溶性提取物作为诱导子研究其对人参毛状根生长和人参皂苷类次生代谢成分生物合成的影响,结果表明,与中剂量浓度的3R-2诱导子共培养21天后,人参毛状根的鲜重、人参皂苷Rg2的含量和人参皂苷Rc的含量的含量相比其他组别更高,因此确定中剂量浓度为最佳浓度。4.通过对长白山产栽培人参和人参毛状根组织的包埋切片和HE、六铵银及免疫荧光染色,观察到栽培基地新鲜人参根、茎、叶、果组织切片在显微下的形态及内生真菌的存在,发现茎和果组织中的菌斑最为明显;观察到几株重要内生真菌对人参毛状根组织的侵染情况,发现其主要侵染部位是周围的薄壁细胞。为将来研究内生真菌对植物组织的侵染途径提供一定的实验基础。5.通过对人参皂苷次生代谢途径中4个关键酶基因HMGR、SS、SE和DS的rtPCR,结果表明,活菌丝体组的关键酶基因SS在第6天时显著高于对照组且达到最高,而诱导子组的关键酶基因HMGR、SE和DS在第15天时达到最高值,且分别是对照组的90倍、20倍和120倍以上。6.本研究通过代谢组学的研究手段明确了3R-2菌丝对人参毛状根的影响和对人参皂苷类成分生物合成的促进作用;对不同时间点的3R-2处理组和空白对照组人参毛状根甲醇提取物正、负离子模式质谱处理后,正极得到2166个化合物,负极2189个化合物。Heatmap图表明,大量化合物经处理后有显著提高和下降;PCA聚类分析发现随处理时间增加,代谢差异越显著。