广西三黄鸡抗马立克氏病相关基因筛选的初步研究

作     者：左天荣 

作者单位：广西大学 

学位级别：硕士

导师姓名：韦平

授予年度：2005年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：马立克氏病 抗性 YL040920分离株 霞烟鸡 抗MD相关基因筛选 

摘      要：马立克氏病(MD)是鸡的一种淋巴组织增生性疾病,对养鸡业危害极大。开展广西三黄鸡抗MD相关基因筛选的研究,旨在确立相应的分子遗传学标记来促进三黄鸡的抗MD育种工作,可弥补以疫苗接种为主的MD防制手段的不足。至此,已完成如下工作: 应用鸭胚成纤维细胞(DEF)从已免疫CV1988疫苗并患MD肿瘤的三黄鸡中分离到一株MDV(命名为YL040920株)。在DEF上进行该毒株的蚀斑克隆试验,9个克隆在蚀斑形成时间及其形态大小上均无明显差别,表明该毒株较为单一;扩增并测定了该毒株的致瘤相关基因meq的核苷酸序列以及与其它MDV-1参考毒株的序列进行比较与分析,结果发现其序列符合MDV-1强毒株的特征;用基于抗MDV-1 MEQ蛋白的单克隆抗体3G12E6的免疫荧光试验(FA)对该毒株的DEF培养物进行检测,结果发现特异性的荧光定位于细胞核内。这些均表明YL040920株属MDV-1的强毒株。用该毒株接种1日龄良凤白鸡和华桂土鸡后,在30日龄左右即可诱发明显的内脏器官肿瘤,表明该毒株具有急性致瘤性。用建立的禽肿瘤病三重聚合酶链式反应(PCR)鉴别诊断技术对该毒株的DEF培养物以及感染鸡的多个器官组织进行检测,均能扩增到MDV-1强毒株的特异性带型,而无网状内皮增生症病毒(REV)和禽白血病病毒(ALV)。以上的证据表明YL040920株为单一的MDV-1强毒株,无REV、ALV以及CV1988疫苗株的混杂,并具有急性致瘤的特性。 用YL040920株MDV接种1日龄的32羽抗MD霞烟鸡种鸡群后代(K群)和34羽未经抗病选育的普通霞烟鸡(Y群)。至85日龄,K群和Y群在死亡率分别为91%与97%,肿瘤发生率分别为38%与44%,死亡高峰均出现在5周龄左右,结果表明Y群比K群对MD更易感,但区别不十分明显。这或许是因为YL0400920株毒力过强所致。用血凝抑制(HI)试验测定试验鸡血清NDV抗体的效价,结果发现在经过三次和四次ND疫苗免疫后其HI抗体仍分别维持在一个较低的水平(分别为2和2,这表明了MDV感染霞烟鸡后产生了明显的免疫抑制作用。 用限制性内切酶Sac I和Msp I分别对28份霞烟鸡生长激素基因第4内含子(GH1)基因PCR扩增产物进行限制性内切酶片段长度多态性(RFLPs)分析,结果发现GH1仅有的一个Sac I酶切位点不具备有多态性;并发现了与Msp I酶切位点相应的4种基因型—AA、AB、AC和CC,