橙皮苷酶与柚苷酶的发酵条件及其应用研究

作     者：曹小燕 

作者单位：浙江工业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：汪钊

授予年度：2007年

学科分类：081703[工学-生物化工] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 0836[工学-生物工程] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 

主      题：橙皮苷 柚皮苷 橙皮素单糖苷 柚皮素单糖苷 橙皮苷酶 柚苷酶 

摘      要：橙皮苷酶和柚苷酶分别是水解橙皮苷和柚皮苷的关键酶，可以得到橙皮素单糖苷、柚皮素单糖苷、橙皮素和柚皮素等产物，它们都具有很高的应用价值。 本课题采用黑曲霉(Aspergillus niger WZ001)发酵同时制备橙皮苷酶和柚苷酶，优化培养条件，发现选择麸皮为碳源，加量为1％，豆饼粉为氮源，加量为1～3％，磷酸盐选择(NH)HPO时，所得酶液活性较高。再经温度、pH等条件的优化，橙皮苷酶和柚苷酶的酶活分别达到1090.6U／mL和1083.9U／mL，比采用基础培养基培养时都提高了约50％。在此基础上进行发酵动力学研究，其结果能够反映发酵过程中菌体量与产酶量的变化情况，与实际拟合较好，可用于指导工业生产。 采用固定化酶既能发挥酶的催化特性，又能回收，并可多次反复使用，使整个生产工艺实现连续化、自动化。本文通过选择较好的固定化方法，并进行优化，从而制备出经海藻酸钠包埋的固定化橙皮苷酶和柚苷酶，研究酶学性质，得出最适反应温度分别为60℃和50℃，最适pH分别为3.5和5.5，米氏常数Km分别为6.0mmol／L和2.67mmol／L，与游离酶相比，热稳定性和酸碱稳定性都有很大程度的提高，分批反应和连续反应稳定性都较好。为得到应用价值较高的中间产物橙皮素单糖苷和柚皮素单糖苷，本文选择橙皮苷酶进行实验，研制了填充床固定化酶反应器。该反应器采用逆流方式，控制流速在2～3mL／min，至少保证稳定使用9天，生产强度维持在1.44～1.53μg／mL／min，可见反应器稳定性较好。同时还对填充床固定化酶反应器的动力学模型进行初步研究，适宜用于指导工业生产。 本文还利用超滤和酒精沉淀法，制备了适宜保藏，使用方便的粉状食品级酶制剂。经超滤浓缩所制的液体酶，其橙皮苷酶和柚苷酶的平均酶活分别可达到4725.9 U／mL和4508.5 U／mL，为最初料液的5～6倍。采用2.7倍酶液体积的无水乙醇沉淀时，同时加1％淀粉，收集沉淀45℃烘干再经粉碎，可得颗粒均匀，外观较好，无异味的白色食品级酶粉，其橙皮苷酶和柚苷酶的酶活分别达48150.4U／g和37596.5U／g，总回收率分别为88.1％和59.4％，可以用于产业化。 采用大孔吸附树脂A对橙皮苷和柚皮苷改性产物进行分离纯化，研究其吸附性能和洗脱条件。研究发现，可选择20％的乙醇水溶液作为洗脱剂，流速2mL／min，通过洗脱完全分离橙皮素单糖苷和橙皮素，柚皮素单糖苷和柚皮素。最后经减压蒸馏除去乙醇，静置，过滤，烘干，即得橙皮素单糖苷和柚皮素单糖苷，纯度分别可达95％和93％，总回收率分别为83.8％和71.2％。