氧化葡萄糖酸杆菌中两个NADPH依赖的氧化还原酶基因的克隆表达及其酶学性质分析

作     者：陈珉珉 

作者单位：华东理工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：马昱澍

授予年度：2010年

学科分类：08[工学] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 

主      题：氧化葡萄糖酸杆菌 NADPH依赖的醛还原酶 NADP+依赖的甘油脱氢酶 酶学性质 

摘      要：氧化葡萄糖酸杆菌不完全氧化碳源底物的能力使其具有巨大的应用价值。随着全基因组序列的公布,对于该菌的分子生物学研究有了快速发展。本研究发现氧化葡萄糖酸杆菌细胞质中两个未知功能的基因(gox0644和gox1615)与醛酮还原酶家族的成员具有60-70%的序列同源性,含有醛酮还原酶家族高度保守的天冬氨酸-酪氨酸-赖氨酸-组氨酸构成的催化四聚体。通过构建重组表达质粒,在大肠杆菌BL21中诱导表达可溶性的蛋白,Ni柱纯化得到单一条带的重组蛋白,分子量分别约为32KDa和50KDa。 针对所获得的重组酶蛋白的底物谱研究表明,gox0644和gox1615都以NADPH为辅酶,都对醛具有较高的还原活性。其中GOX0644对于芳香醛底物的活性高于脂肪醛,且对氯取代的苯甲醛好于硝基取代的苯甲醛,对单糖与酮底物反应活性微弱,基本没有醇的氧化活性,确定GOX0644为NADPH依赖的醛还原酶(Aldehyde reductases)。GOX1615更适合于催化脂肪醛的还原,对DL-甘油醛反应活性最高,底物特异性与Hypocrea. Jecorina的NADP+依赖的甘油脱氢酶有很大的相似性,把它归为甘油脱氢酶。实验还测定了它们的最适反应pH、最适反应温度、酸碱稳定性、热稳定性及相关酶动力学参数。