超声辐照微泡增强脂质体介导肝细胞基因转染的实验研究

作     者：苏琳 

作者单位：重庆医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王志刚

授予年度：2007年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：超声 微泡 L02细胞 基因转染 超声 微泡 L02细胞 脂质体 基因转染 

摘      要：第一节超声辐照微泡促进肝细胞基因转染的参数优化 目的:观察超声辐照微泡对正常肝细胞生长状态的影响并优化其促进肝细胞株L02基因转染的参数。 方法:采用MTT比色法检测单纯超声、单纯微泡和超声辐照微泡对正常肝细胞（L02细胞）生存率的影响及用荧光显微镜和流式细胞仪观察和检测超声辐照微泡介导EGFP质粒对L02细胞基因转染的效率,并以此优化声照参数和微泡剂量。 结果:MTT比色法结果发现:当固定声强为0.5 W/cm,辐照时间为30 s、60 s和90 s时,各组细胞存活率分别为92.45%、85.78%和31.65%;采用不同浓度微泡对L02细胞作用24 h后,各实验组细胞存活率与空白对照组细胞存活率比较无显著性差异（P0.05）;超声+微泡（40μl）组L02细胞,光密度值下降,细胞存活率降低,与对照组比较差异有显著性。超声辐照微泡10μl、20μl、30μl各亚组的L02细胞生长状态良好;荧光显微镜观测发现在超声辐照微泡组及脂质体组均可见明亮的绿色荧光,对照组组未见荧光;流式细胞仪分析各组转染效率显示脂质体组、超声辐照微泡10μl微泡亚组、20μl微泡亚组、30μl微泡亚组、40μl微泡亚组转染效率分别为18.30%、10.14%、14.65%、18.54%、10.06%,而对照组未见基因转染。 结论:超声频率为1MHz、能量为0.5 W/cm辐照微泡（微泡浓度1.8×10～7个/ml）辐照时间为60秒可显著促进EGFP基因在L02细胞的表达,并对L02细胞生长状态无明显影响。 第二节超声辐照微泡增强脂质体介导肝细胞基因转染的实验研究 目的:观察超声辐照微泡联合脂质体介导pIRES-EGFP/HGF质粒对人正常肝细胞株L02的基因转染效率。 方法:将培养的肝细胞分为5组,①单纯对照组,②脂质体转染组,③超声辐照脂质体转染组,④超声辐照微泡转染组,⑤超声辐照微泡+脂质体转染组。采用荧光显微镜和流式细胞仪法观察及检测各组L02细胞pIRES-EGFP/HGF质粒转染的情况及效率;用MTT和ELISA法分别检测各组L02细胞增殖率及上清液中HGF含量。 结果:流式细胞仪检测结果显示脂质体组、超声辐照脂质体组、超声辐照微泡组、超声辐照微泡+脂质体组转染效率分别为18.32%、18.46%、18.47%、23.17%,对照组未见基因转染。ELISA法结果显示,超声辐照微泡+脂质体转染组细胞上清液中HGF含量最高与其余各组比较差异有显著性（P0.05）;MTT比色法结果显示对照组、脂质体组、超声辐照脂质体组、超声辐照微泡组、超声辐照微泡+脂质体组L02细胞增殖率分别为100%、117.79%、119.52%、118.44%、123.21%。 结论:超声辐照微泡可明显增强脂质体介导pIRES-EGFP/HGF转染人肝细胞株L02的效率,其效率明显高于单纯超声辐照微泡组、超声辐照脂质体组及单纯脂质体组。