基于Src-PI3K-Akt通路探讨健骨颗粒乙酸乙酯萃取部位对破骨细胞功能的影响

作     者：王柄棋 

作者单位：福建中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：林燕萍

授予年度：2018年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：健骨颗粒 萃取 RAW264.7 破骨细胞 骨吸收功能 Src 

摘      要：目的:通过对健骨颗粒乙酸乙酯部位的萃取和破骨细胞的诱导,观察健骨颗粒乙酸乙酯萃取部位对破骨细胞Src-PI3K-Akt通路的影响,探讨其对破骨细胞功能的干预作用及作用机制。方法:1健骨颗粒乙酸乙酯萃取部位的制备首先将健骨颗粒药液(2.9g/ml生药)倒入分液漏斗中,其次加入1/3药液体积的乙酸乙酯有机试剂重复萃取4次,再次将健骨颗粒乙酸乙酯萃取部位依次经过旋转蒸发仪和水浴锅的蒸发制成浸膏,最后将浸膏放置于真空干燥箱中抽干,研钵碾磨成粉状,置于干燥缸中保存备用。2破骨细胞的诱导取生长状态良好的RAW264.7细胞,按2.5X 104/cm2的浓度接种于6孔细胞培养板,用RANKL(50ng/ml)诱导培养7d后得到破骨细胞。破骨细胞的鉴定:倒置相差显微镜观察培养的破骨细胞的形态、TRACP染色法检测酶活性。3细胞干预和实验分组RAW264.7细胞根据不同的干预药物分为对照组(加入不含药物的50ng/ml RANKL完全培养基)、药物组[加入含健骨颗粒乙酸乙酯萃取部位(10ng/ml)的50ng/ml RANKL完全培养基]、抑制剂组[加入含Src蛋白抑制剂达沙替尼(0.8nM)的50ng/ml RANKL完全培养基]、混合组(加入同时含Src蛋白抑制剂达沙替尼和健骨颗粒乙酸乙酯萃取部位的50ng/ml RANKL完全培养基,药物剂量均同抑制剂组和药物组)。4指标检测运用MTT法检测细胞增殖绘制增殖曲线,选择最佳干预药物浓度;采用Western Blot、Real time PCR 检测 c-Src、PI3K、Akt、NFATcl 蛋白和基因的表达水平;TRACP染色对破骨细胞计数和甲苯胺蓝染色对骨吸收陷窝计数。结果:1破骨细胞鉴定结果:RAW264.7细胞在RANKL因子(50ng/ml)刺激下诱导培养7d时获取大量的多核巨细胞,形态最佳,镜下可见核多达几十个,TRACP染色将细胞包浆染成紫红色,故符合鉴定标准。2最佳药物浓度选择:MTT检测发现3个时间点(24h、48h、72h)健骨颗粒乙酸乙酯萃取部位浓度(1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml)的增殖速度均高于同期对照组,当药物浓度为10ng/ml,细胞增殖作用最强(P0.05),其余各用药物组差异均有统计学意义(P0.05),其余各用药组差异有统计学意义(P0.01或P0.05)。结论:1 RAW264.7细胞在50ng/ml RANKL因子刺激下培养7d获取的破骨细胞状态最佳,为开展后续实验奠定了基础。2健骨颗粒乙酸乙酯萃取部位对RAW264.7细胞在RANKL诱导下向破骨细胞的分化以及诱导后的破骨细胞骨吸收活性有明显的抑制作用;其抑制作用可能是通过降低破骨细胞SrcmRNA和蛋白的表达,进而下调其下游PI3K、Akt、NFATc1mRNA及蛋白表达来实现的。