树舌灵芝FIP在毕赤酵母中的优化表达及与赤灵芝、紫芝FIP的比较

作     者：段作文 

作者单位：沈阳农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：林景卫

授予年度：2017年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 10[医学] 

主      题：真菌免疫调节蛋白 重组表达 生物学活性 比较分析 

摘      要：真菌免疫调节蛋白(FIP)是近年来从高等真菌中发现的一类结构与免疫球蛋白重链可变区相似的小分子蛋白,具有明显的免疫调节、抗过敏、抗病毒、抗肿瘤等活性,且没有任何毒副作用,具有开发成免疫调节剂和药物的潜力。本论文主要由两部分组成。第一部分为树舌灵芝FIP基因的优化、重组表达和生物学功能的验证。为研究树舌灵芝的活性成分及生物学功能,采用同源克隆的方法从树舌灵芝子实体基因组中克隆出两种树舌灵芝FIPs基因(FIP-gap1和FIP-gap2)。根据毕赤酵母对密码子使用的偏爱性,优化FIP-ga即1/2基因,并在其C端添加组氨酸标签序列,构建重组表达载体pPIC9-His-FIP-gap1/2。利用毕赤酵母GS115高效重组表达FIP-gap1/2。SDS-PAGE 和 Western blot 结果表明,rFIP-gap1/2 大约在 14 KDa 和 17 KDa处有蛋白条带,重组蛋白正确表达。rFIP-gap1/2在第4天的表达量最高,表达量分别达到207.4和157.5 mg/L,远高于未经优化的FIP-gap1和FIP-gap2的表达量(2.66和4.56 mg/L)。rFIP-gap1/2经过HIS TrapTM FF柱层析纯化、透析和冷冻干燥,获得纯化的rFIP-gap1/2,并进行体外生物活性检测。结果表明,rFIP-gap1在浓度为1μg/mL时就能够凝集人、小鼠和羊的血细胞,而rFIP-gap2只有当浓度达到8 μg/mL以上时才能凝集这三种血细胞;rFIP-gap1/2也都可以促进小鼠脾淋巴细胞增殖,且最佳作用浓度均为4μg/mL;除此之外,rFIP-gap1/2还能够明显地促进细胞因子IL-2和IFN-y的分泌,促进IL-2的表达量分别为622.5和416.5 pg/mL,而促进IFN-y的表达量分别为1381和1624 pg/mL;采用MTT法测定rFIP-gap1/2对A549、Hela和MCF-7三种癌细胞的抑制效果,结果表明,rFIP-gapl对A549、Hela和MCF-7三种细胞抑制效果较好,在浓度为32 μg/mL时,抑制率分别为 53.7%、82.9%和 82.5%,IC50值分别是 29.89%、8.34%和 12.19 μg/mL。同样的浓度下,rFIP-gap2对A549和Hela细胞抑制效果不好,抑制率分别为13.9%和8.7%,IC50值分别为60.92和41.05μg/mL,而对MCF-7细胞的抑制效果较差,没发现抑制作用。经毕赤酵母的高效重组表达,成功的获得具有生物学活性的rFIP-gap1/2。这为树舌灵芝FIP进一步开发和实践应用提供理论依据。第二部分为rFIP-gap1/2、rLZ-8和rFIP-gsi的比较分析。人工合成LZ-8和FIP-gsi基因,构建诱导型重组表达载体pPIC9-His-LZ-8和pPIC9-His-FIP-gsi,然后转入毕赤酵母。经SDS-PAGE和Western blot结果证明LZ-8和FIP-gsi成功表达,表达量分别为133.6和124.3 mg/L。重组蛋白经组氨酸凝胶柱纯化、透析、冻干处理后获得纯化的rLZ-8和rFIP-gsi,进行体外生物学活性检测,并与rFIP-gap1/2的生物学功能进行比较分析。结果表明,当rFIP-gap1、rLZ-8和rFIP-gsi的浓度为5 μg/mL时都能够凝集人、小鼠和羊的血细胞,而rFIP-gap2在同样的浓度下却不能凝集这三种血细胞;rFIP-gap1/2、rLZ-8和rFIP-gsi(5 μg/mL)也都能够明显的促进小鼠脾淋巴细胞增殖,但作用效率不同;rLZ-8和rFIP-gsi(5 μg/mL)还能够明显地促进细胞因子IL-2和IFN-y的分泌,rLZ-8和rFIP-gsi促进脾淋细胞释放IL-2的表达量分别为524.5和236.5 pg/mL。而促进脾淋细胞释放IFN-γ的表达量分别达到了 606和1538 pg/mL;同时,采用MTT法测定rLZ-8和rFIP-gsi对A549、Hela和MCF-7三种癌细胞的抑制效果。rLZ-8在浓度为16 μg/mL时,对A549、Hela和MCF-7三种细胞抑制率分别为25.1%、33.9%和18.7%,IC50值分别为21.65、17.53和31.38 μg/mL。rFIP-gsi在浓度为16 μg/mL时,对Hela和MCF-7细胞的抑制率分别为23.7%和17.1%,而对A549、Hela和MCF-7三种细胞的IC50值分别68.04、19.44和39.89 μg/mL。rFIP-gap1/2与rLZ-8和rFIP-gsi的生物学活性比较分析,对进一步全面阐明FIP的生物学功能具有重要科学意义。