将与皮肤组织块共培养的骨髓间充质干细胞移植至大鼠皮肤创面后对愈合效果的作用研究
作者单位：山西医科大学
学位级别：硕士
导师姓名：段鹏;张宝林
授予年度：2015年
主 题：骨髓间充质干细胞 分离培养 表面标志物 皮肤组织块 共培养 全层皮肤缺损 BrdU标记 创面愈合指数 免疫荧光技术
摘 要：第一部分大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定并与新生大鼠皮肤组织块进行共培养目的:在体外分离提取出大鼠的骨髓间充质干细胞(BMSCs),培养,扩增以后观察其生长形态、测定生长曲线和对其表面标志物进行鉴定,旨在培养出纯度较高的BMSCs与新生大鼠皮肤组织块进行共培养。方法:1.经过几种不同方法的研究于对比,我们选取全骨髓贴壁培养法来进行BMSCs的分离、培养和纯化。在无菌条件下抽取健康SD大鼠(8周龄左右、约150g)股骨和胫骨的骨髓,离心后重悬细胞接种于培养瓶中,置于37℃、5%CO2培养箱中培养,经过换液和传代去除掉其他细胞。得到纯度较高,单一性的细胞。2.我们对分离出来的细胞贴壁生长的形态变化进行观察和记录。然后选取第三代生长状态良好的细胞进行了MTT法检测细胞生长曲线,并绘制了生长曲线图。3.我们分别应用了细胞免疫荧光技术和流式细胞术来检测细胞表面标志物CD34、CD44、CD45、CD105的表达情况。4.将新生大鼠的皮肤组织块与P3-P5的BMSCs放入transwell共培养皿中进行培养。结果:1.细胞的生长形态观察:细胞接种于培养瓶后24小时换液,以后3-4天换一次液,观察可见原代细胞贴壁生长后呈现出圆形,梭形,星型等不规则形状,随着时间的增加细胞形态逐渐趋于一致并且集落生长,散在分布。2.细胞生长曲线测定:结果显示生长曲线呈现出典型的“S“形,即潜伏适应期、对数生长期和平台期。3.细胞表面标志物检测:我们所用的两种方法结果显示,CD44、CD105的阳性率表达非常高,CD45、CD34的阳性率表达很低。结论:1.通过全骨髓贴壁培养法成功分离提取出了大鼠BMSCs,并且P3-P5的BMSCs纯度较高,活性较好。2.我们选取P3-P5生长状态良好的BMSCs与新生大鼠的皮肤组织块共培养后,用于第二部分的实验研究。第二部分大鼠背部全层皮肤缺损模型制备并将共培养的细胞标记后植入创面对愈合效果的作用研究目的:1.熟练掌握大鼠脊柱两侧全层皮肤缺损模型的构建。2.大鼠的BMSCs与新生大鼠的皮肤组织块共培养后对创面愈合的影响和单纯BMSCs对创面愈合的影响进行比较,观察是否能加快创面愈合并探讨其机制。为临床上皮肤缺损的治疗提供新的思路和方法。方法:3.大鼠背部全层皮肤缺损模型的制备:选取健康SD大鼠12只,水合氯醛腹腔注射麻醉,每只大鼠背部从头至尾依次制作3组直径为2cm全层皮肤缺损的圆形创面,脊柱两侧对称分布,创面间隔为2cm。4.实验分组:每只大鼠背部6个创面,脊柱两侧对称分布,从头至尾依次分为皮肤与BMSCs共培养组(A组),单纯BMSCs组(B组),无菌PBS对照组(C组)。5.细胞移植:在创面中心和边缘筋膜下A组注射和皮肤组织共培养的Brdu标记的BMSCs,B组注射单纯Brdu标记的BMSCs,C组注射无菌PBS。A、B的移植细胞数为2X107个。6.创面的观察:我们观察模型创面3、7、14、21天的恢复情况,描述创面的渗出和肉芽组织增生情况并计算创面愈合指数(WCI)WCI=(1-处理后创面面积/原始创面面积)x100%。7.用免疫组织荧光的方法来检测创面中Brd U、增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、Integrinβ1(L-16)阳性率的表达来探讨创面修复情况的不同。结果:1.创面观察:我们观察到创面的渗出和肉芽组织增生每组都有发生,三组的差距不是很明显。但是测量创面面积,计算创面愈合指数,用SPSS13.0软件进行统计学分析得到结果显示3组之间的创面愈合速度是有差别的,其中A组的创面愈合速度是最快的,B组次之,C组最慢。2.免疫组织荧光结果:A、B两组中可以见到Brd U标记的BMSCs,C组中基本没有。PCNA和Integrinβ1阳性细胞在A、B、C三组中都有表达,其中A、B两组要比C组阳性表达明显。但两者呈现出相反的趋势,PCNA随着天数的增加A组的阳性细胞比B组多,且每一组随着天数的增加阳性表达也增加,Integrinβ1的阳性表达A组比B组少,且每一组随着天数的增加阳性表达在减少。结论:新生大鼠的皮肤组织块可以对BMSCs起到一定的作用,促使BMSCs在创面中更多的向皮肤细胞分化,让其能够更快更好的促进创面的愈合。
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