新城疫病毒陕西分离株P基因进化分析及V基因真核表达

作     者：韩青松 

作者单位：西北农林科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杨增岐

授予年度：2010年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：新城疫病毒 P基因 V基因 遗传进化 真核表达 

摘      要：新城疫（Newcastle disease,ND）又名亚洲鸡瘟,是由新城疫病毒（Newcastle diseas virus,NDV）引起的禽类的急性、高度接触性、致死性传染病。该病在世界范围内广泛流行,是引起我国养禽业中经济损失的重要疾病之一。对ND的分子流行病学研究不仅能为防控ND提供指导,还能揭示NDV在我国的流行和进化,是目前研究ND流行病学的重要途径之一。对NDV基因功能的研究,不但有利于阐明NDV感染机体后机体的动态反应,而且可以为新型疫苗的研发提供基础。本研究克隆得到了这3株不同动物源NDV P基因序列,分析了P基因的变异及进化情况;用人工定点突变的方法以P基因为模板克隆到了3株病毒的V基因,用生物学分析工具分析了V蛋白的一级和二级结构特点;以PEGFP-C1为载体,构建了V基因真核表达质粒,摸索得到了V基因真核表达的条件,并对表达的产物进行了鉴定;主要研究内容如下: 1、增殖了3株实验室保存的NDV,NnShX05、ChickenShX08、PigeonShX03,用TA克隆的方法得到了P基因的全长序列。比较了他们和Gene Bank上其他毒株的P基因序列,构建了遗传进化树。结果显示:NnShX05和参考毒株核苷酸和氨基酸的同源性分别为82.1%～99.8%和81.1%～100%;ChickenShX08和参考毒株核苷酸和氨基酸的同源性分别为82.1%～100%和81.1%～100;PigeonShX03和参考毒株核苷酸和氨基酸的同源性分别为82.4%～93.1%和79.1%～93.2%;NnShX05和ChickenShX08的核苷酸序列仅存在2个碱基的差异,他们和PigeonShX03序列差异较大;NnShX05和ChickenShX08均和EU296519.1TW06-316亲缘关系最远,和HB92 isolate V4亲缘关系最近,PigeonShX03和EU4199882.1D58亲缘关系最远,和EU296531.1TW84-P72亲缘关系最近。遗传进化分析表明:NnShX05和ChickenShX08可能来源于疫苗毒株,PigeonShX03由台湾毒株进化而来或是与其拥有共同的祖先。 2以3株P基因克隆质粒为模板,运用大引物法进行人工定点突变,克隆得到了3株病毒的V基因。比较发现NnShX05和ChickenShX08 V基因只有一个核苷酸的差异,编码氨基酸序列完全相同;NnShX05、ChickenShX08 V基因核苷酸序列以及推导氨基酸序列和PigeonShX03差异较大。V蛋白结构预测表明:NnShX05和PigeonShX03 V蛋白的氨基酸组成个数相等、在相同的位点形成糖基化位点和Zn指结构,但是他们的氨基酸组成、等电点不同,且存在1个酰基化位点7个磷酸化位点的差异。结果表明:不同动物源NDV V蛋白拮抗干扰素能力可能不同。 3、以PEGFP-C1为载体构建了以绿色荧光蛋白为报告基因的V基因真核表达质粒。通过转染真核细胞,研究NDV V基因在体外真核细胞中的表达情况。结果显示NDV V基因能在Vero中较高效表达,Western-blotting鉴定表明,表达的蛋白有良好的反应原性,能和NDV抗血清发生特异性反应。为体外研究不同动物源NDV V蛋白拮抗干扰素能力的差异奠定基础。