山茱萸环烯醚萜苷对EAE小鼠小胶质细胞活化的调节及机制探究

作     者：屈赵 

作者单位：广州中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王奇;尹琳琳

授予年度：2015年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：山茱萸环烯醚萜苷 小胶质细胞 神经炎症 JAK/STAT信号通路 

摘      要：目的:多发性硬化(multiple sclerosis,MS)为中枢神经系统(central nervous system,CNS)以白质炎性脱髓鞘为主要病理特点的慢性自身免疫性疾病,小胶质细胞(microglia)是一种特殊类型的髓样细胞,为CNS中固有的免疫细胞,其作用相当于CNS内的巨噬细胞,构成CNS最主要的一道免疫防线。山茱萸环烯醚萜苷(cornel iridoid glycoside,CIG)为首都医科大学宣武医院药物研究室自主研发的从中药山茱萸中提取的有效成分,既往研究发现CIG具有抗炎、免疫调节、神经营养等作用。为进一步明确CIG发挥免疫炎症调节的作用机理,本研究从MS的实验动物模型着手,探讨CIG的抗免疫炎症作用,并通过体外细胞模型进一步探讨其具体的作用机制,为开发MS的治疗药物提供新的实验依据。方法:1.用MOG35-55诱导C57BL/6J小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)模型模拟MS。实验分为空白对照组、EAE模型组、CIG 50 mg/kg组、CIG 100 mg/kg组。MOG35-55免疫诱导当天给予CIG保护治疗,每天记录各组动物体重和神经功能评分的变化。24天后取脑组织,用免疫组化法检测髓鞘(MBP标记)、小胶质细胞(Iba-1标记)在脑内的变化。2.采用细菌脂多糖(LPS)和γ-干扰素(IFN-γ)复合诱导小鼠小胶质细胞系BV2细胞炎症反应,建立拟MS小胶质细胞活化的体外细胞模型。实验分为空白对照组,空白+给药对照组(CIG100 μg/mL),LPS/IFN-γ模型组,CIG25、50、100、200 μ g/mL 组。CIG 与 BV2 细胞预孵育 0.5 h,再经 LPS 复合 IFN-γ与BV2细胞共同孵育24 h后收集细胞样品进行检测。用Western Blot方法检测JAK/STAT(janus kinase/signal transducer and activator of transcription)信号通路中 IL-6、IL-6Rα、gp130、p-JAK1、JAK1、p-JAK3、JAK3、p-STAT1(Y701)、p-STAT1(S727)、STAT1、p-STAT3(Y705)、p-STAT3(S727)、STAT3 蛋白表达水平,并检测NF-κB、COX-2、iNOS、ICAM-1蛋白的表达。3.采用LPS和IFN-γ复合诱导小鼠小胶质细胞系N9细胞炎症反应,建立拟MS另外一种小胶质细胞活化的体外细胞模型。实验分为空白对照组,空白+对照给药组(100 μg/mL),LPS/IFN-γ 模型组,CIG50、100、200 μg/mL 组。CIG与N9细胞预孵育0.5 h,再经LPS复合IFN-γ与BV2细胞共孵育24 h后收集细胞样品进行检测。用Western Blot方法检测p-STAT1(Y701)、p-STAT1(S727)、STAT1、p-STAT3(Y705)、p-STAT3(S727)、STAT3 蛋白表达水平。并用米诺环素作为阳性对照药物,免疫荧光法检测CIG是否能够干预LPS和IFN-γ与其相应受体的结合。结果:***35-55能成功诱导C57/BL6J小鼠经典EAE模型,且给予CIG 100mg/kg剂量组能明显缓解模型动物的神经功能损伤症状。免疫组化染色结果显示EAE模型小鼠的髓鞘脱失并不显著,但有明显的中枢小胶质细胞活化,CIG能够抑制小胶质细胞在脑内的过度活化。***/IFN-γ复合刺激BV2细胞能激活NF-κ B信号通路和JAK/STAT信号通路,并增加炎性相关蛋白C0X2、iNOS、ICAM-1的表达。(1)NF-κB是一种重要的核转录因子,与I-κB结合存在于胞浆中,在炎性刺激条件下I-κ B降解而激活NF-κ B,从而NF-κ B进入核内参与炎症相关基因的转录。本实验发现,LPS/IFN-γ模型组NF-κB被激活,但CIG对NF-κB的活化没有抑制作用。(2)JAK是非受体型酪氨酸蛋白激酶,在炎性刺激条件下会磷酸化激活,从而引起STAT转录信号的激活并影响相关炎性因子的合成和分泌。本实验发现,LPS/IFN-γ复合刺激BV2细胞能引起IL-6受体(IL-6Rα、gP130)的激活,并诱导 JAK1、JAK3、STAT1、STAT3 的磷酸化激活。CIG 100、200 μg/mL 能够明显抑制 IL-6 受体(IL-6Rα、gP130)的激活,并降低 p-JAK1、p-JAK3、p-STAT1(Y701)、p-STAT1(S727)、p-STAT3(Y705)、p-STAT3(S727)的磷酸化水平。(3)C0X2是LPS等刺激后参与炎症