木糖制备乳酸高产菌的诱变选育和工艺优化

作     者：蔡聪 

作者单位：南京林业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：欧阳嘉

授予年度：2013年

学科分类：08[工学] 0822[工学-轻工技术与工程] 082203[工学-发酵工程] 

主      题：凝结芽孢杆菌 L-乳酸 等离子体注入 木糖 发酵 

摘      要：乳酸做为三大有机酸之一，是一种重要的多用途有机酸，尤其是L-乳酸，以其独特的构型优势，展示了广泛的应用前景。本文选择木糖为原料和嗜热菌株凝结芽孢杆菌NL01作为发酵菌株，利用等离子体注入诱变技术提高菌株对木糖的利用率，研究如何高效利用木糖和酸爆玉米秸秆水洗液生产L-乳酸的技术。研究的主要内容如下： 首先对富含木糖的酸爆玉米秸秆水洗液进行发酵试验，确定了凝结芽孢杆菌利用水洗液发酵的可行性，并且通过对水洗液成分的分析，制定了不同抑制物对其发酵的影响，经过试验可以知道：甲酸浓度为2g/L时出现明显的促进作用;乙酸作为水洗液中浓度最高的成分，可以耐受在不多于10g/L的范围内。羟甲基糠醛浓度为1g/L时表现出明显的促进作用;乙酰丙酸和糠醛浓度不超过0.5g/L和0.25g/L时均表现出一定程度的促进作用。经验证，水洗液主要抑制物对凝结芽孢杆菌发酵无明显影响。 因为目前大部分生产L-乳酸的菌株在木糖利用上的缺陷，本论文以野生型凝结芽孢杆菌NL01作为出发菌株，采用等离子体诱变育种技术选育，并通过高糖高酸的快速筛选平板，简化筛选过程，有效的找到一株木糖发酵特性优良的L-乳酸高产菌株N01-17。诱变条件是控制离子注入机功率在100W左右，辐照距离2.5mm，氦气通量10slpm，实验结果显示最佳辐照时间为60s。菌株N01-17发酵测定结果是L-乳酸最高产量为83.20g/L，较出发菌株提高了21.5%，糖酸转化率提高了16.0%。 通过单因素实验和Plackett-Burman实验方法，对诱变菌株N01-17生产L-乳酸的培养条件和培养基的主要因子进行了优化和筛选。确定最有发酵条件为发酵用封口为橡皮塞，发酵的温度选择为50℃，培养时摇床的转速为150rpm，起始pH为7.2。发酵培养基配方通过响应面优化后的最佳组合为（g/L）:木糖100，酵母膏9.3，玉米浆干粉4.5，七水硫酸亚铁0.03，一水硫酸锰0.03，碳酸钙50。摇瓶发酵在60h木糖基本被消耗，最后乳酸产量和糖酸转化率为85.12g/L和86.12%。3L发酵罐在发酵120h后乳酸产量和糖酸转化率均达到最高为90.29g/L和94.37%。