机械牵张力对成骨样细胞影响的糖蛋白组学的初步研究
作者单位：第四军医大学
学位级别：硕士
导师姓名：冯雪;陈富林
授予年度：2012年
学科分类：1003[医学-口腔医学] 100302[医学-口腔临床医学] 10[医学]
摘 要：机械力学刺激作为正畸牙周组织改建重要的生物调节因素在骨形成和骨重塑中发挥重要作用。正畸矫治错合畸形的基本原理正是利用矫治器作用于牙齿，使得机械力通过牙体硬组织、牙周膜传递至牙槽骨，引起牙槽骨组织重塑，牙齿因此移动到新位置。适宜的机械刺激可通过影响成骨细胞的增殖活性、表型蛋白的表达和功能促进骨生长与骨重塑。糖蛋白组学方法为全面分析机械力学刺激对骨重塑翻译后修饰、揭示参与骨形成和骨重塑的糖蛋白提供技术支持。为深入研究其机制，我们以糖蛋白组学为技术平台，通过筛选差异蛋白研究力学转导中的重要蛋白质，为应力刺激下骨重塑机理的深入研究提供依据。 本实验通过Flexcell应力加载系统，对人成骨样细胞（MG-63）施以不同加载时间的周期性牵张力，采用凝集素芯片技术分析在不同加载时长情况下成骨样细胞糖链变化，并对差异糖链的相关糖蛋白进行分离富集及质谱鉴定，明确应力刺激骨重塑中差异表达的糖蛋白，分析差异糖蛋白受应力刺激在骨重塑中的作用，为后续的研究提供依据： 1．机械牵张力对成骨样细胞糖蛋白糖链的影响 目的：研究机械牵张力对人成骨样细胞MG-63糖蛋白糖链表达的影响。 方法：以Flexcell细胞应力培养系统对人成骨样细胞MG-63施以形变率为12%，加载时长分别为4h、8h、12h、24h的周期性机械牵张力，利用凝集素芯片技术筛选出糖蛋白糖谱中差异表达的糖蛋白糖链，比较不同载荷时间对成骨样细胞糖链的影响。 结果：8小时实验组表达差异最明显，在加力后实验组凝集素Jacalin、RCA120、LEL、GSL-I、DBA、VVA、ACA的亲和作用增强，而对凝集素WFA、EEL、AAL、LCA、STL的亲和作用减弱，提示在机械牵张力作用下成骨样细胞表面可能出现增多的黏蛋白T/Tn抗原、I-抗原、 N-乙酰半乳糖胺（包括α1-3链接方式）、α及β链接半乳糖结构，而岩藻糖α1-2链接半乳糖、核心岩藻糖、N-乙酰葡糖胺等结构减少。 结论：本文通过凝集素芯片技术研究发现力学刺激下成骨样细胞糖链变化与时间呈相关性，推测在加载4小时后成骨样细胞便出现对信号转导的重要调节修饰，在加载8小时后成骨样细胞半乳糖型糖蛋白明显增加，细胞已具备了某些骨化的早期表现。为研究骨改建信号转导发生机制提供了糖组学理论支持。 2．不同应力成骨样细胞的半乳糖型糖蛋白的分离纯化 目的：利用以琼脂糖微粒为固定载体的凝集素亲和技术，对不同加载时长后的成骨样细胞蛋白样品进行糖蛋白的分离富集，为下一步质谱分析做准备。 方法：以结合榴莲凝集素（Jacalin）及蓖麻凝集素（RCA120）的琼脂糖微粒为载体对成骨样细胞的空白组、8h和24h实验组蛋白样品进行半乳糖型糖蛋白的分离富集。在富集时固定化的凝集素与特定的糖蛋白结合，非结合部分则被洗脱。凝集素与之后洗脱液中的半乳糖竞争性结合，将糖结合物从固定化的凝集素上移除并收集。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳验证分离效果。 结果：SDS-PAGE电泳显示琼脂糖-凝集素亲和层析技术可实现复杂蛋白质较好的分离。 结论：利用琼脂糖微粒做固定化载体，在富集糖蛋白过程中去除非糖蛋白和糖蛋白中的非半乳糖型糖蛋白，降低了样品的复杂性，具有较好的有效性和特异性，为复杂样品的蛋白糖基化研究提供基础。 3．机械牵张力作用下成骨样细胞差异糖蛋白的质谱分析 目的：用液相色谱质谱技术检测不同机械牵张力条件下成骨样细胞蛋白差异表达。根据鉴定结果推测成骨样细胞的差异糖蛋白如何对机械牵张力刺激做出响应。 方法：将实验二中富集后的糖蛋白样品进行酶解脱盐，之后使用液相色谱（LC）分离蛋白质，LTQ Velos质谱仪进行多肽碎片的扫描鉴定并用BIOWORKS软件搜索相应的数据库。最后得到机械牵张力刺激骨重塑相关的差异糖蛋白。 结果：鉴定出24个差异表达糖蛋白，其中4个为空白组成骨样细胞表达升高的糖蛋白，20个为实验组表达升高的糖蛋白。差异表达的糖蛋白主要参与细胞增殖、细胞骨架、信号传导及能量代谢等多个生命活动过程。 结论：力学刺激成骨样细胞引发特征蛋白的功能改变，引起细胞增殖、细胞骨架、信号传导及能量代谢等多个生物学改变。通过糖蛋白组学研究可以筛选参与力传导细胞生命活动过程中的重要糖蛋白，为深入探索其机制提供信息，从而为揭示骨重塑中成骨细胞生命活动的基本规律奠定基础。
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