VSV及其突变体的致病性的研究及M蛋白抗体检测试剂盒的研制
作者单位：南昌大学
学位级别：硕士
导师姓名：毛慧玲;孙涛
授予年度：2013年
学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学]
摘 要：水泡性口炎被国际兽医局(OIE)列为A类传染病,我国则属二类进境动物传染病。该病由水泡性口炎病毒(VSV)引起。VSV基因组编码5个结构蛋白,其中基质蛋白(M)是其重要毒力因子,可阻遏宿主细胞mRNA由胞核向细胞质的转运,并抑制感染病毒的细胞产生I型干扰素IFNa/β,因此病毒得以快速繁殖。囊膜蛋白(G)是VSV另一重要的致病因子,在VSV出芽和包装时起重要作用。同时,VSV病毒是一种有前途的溶瘤病毒和疫苗载体,它具有裂解小鼠肿瘤细胞的能力,且其本身为RNA病毒,病毒基因组不会整合到宿主基因组内,并对人无致病性。但当VSV滴度较高时,会引起小鼠的神经性症状,因此VSV的安全性有待进一步的探索。 本实验通过比较VSV野生型、VSV△M51和VSV△M51-G△28突变株的形成空斑的能力与大小,病毒多步生长曲线与动物学实验,以了解两个突变株的生物性状的变化,以及在体内和体外实验中的弱化情况,并通过实验进一步证明：弱化是由于宿主细胞Ⅰ型干扰素作用和病毒复制能力减低共同作用所致。 本文克隆了印第安那型VSV的M基因,利用在大肠杆菌蛋白表达系统中制备的重组M蛋白建立了特异检测M蛋白抗体的间接ELISA方法,以此为基础,研究了感染VSV小鼠体内M蛋白抗体的变化规律。通过表达并纯化M蛋白为制备多克隆抗体和单克隆抗体提供便利。 本研究的主要结果如下： 1.在缺乏I型干扰素信号的Vero细胞中,VSV和VSV△M51形成的空斑面积无显著差异,且都显著大于VSV△M51-G△28;而在具备I型干扰素信号的A549细胞中,VSV空斑面积显著大于VSV△M51,VSV△M51-G△28较前两者更弱。结果表明,VSV△M51-GA28在M和G蛋白双突变共同作用下较M蛋白单突变的VSV△M51弱化效果更明显。 2.在PC3细胞中进行多步生长曲线实验发现,病毒最高滴度比较为：VSVVSV△M51VSV△M51-G△***峰值在48h出现,而VSV△M51的滴度峰值在24h,到72h后下降;VSV△M51-G△28变化趋势与前者相似但下降更为明显。在IFNp表达水平上呈现VSVVSV△M51-G△28VSV△M51的特点。结果表明：VSV△M51-G△28的弱化受到了I型干扰和病毒复制包装能力弱化双重因素共同制约。 3.在动物实验中,VSV与VSV△M51组较PBS组体重下降明显,且VSV组在第1d时体重开始下降,至第6d时达到最低下降约30%,部分小鼠出现神经症状;VSV△M51组症状相似,但第8-9d时体重降到30%左右并伴随毛杂乱的症状;VSV△M51-G△28组无明显病症,体重在接种后稳定上升,与PBS组相似。结果说明,VSV△M51-G△28突变体较其他两种病毒致病力明显下降。 4.根据M基因序列设计一对引物,以pVSV质粒为模板,克隆出690bp的特异条带,并连接到pET32a(+)质粒上,获得重组质粒,表达M蛋白并纯化,并用SDS-PAGE及Westem-blotting验证该重组蛋白活性。结果表明,成功获得重组质粒及有生物学活性的重组M蛋白。 5.以重组M蛋白为抗原建立ELISA检测方法,通过方阵滴定优化蛋白最佳包被浓度为12μg／ml和一抗稀释度为1：5000。 6.在抗VSV M抗体的消长规律及体重变化的实验中表明,VSV感染可激发小鼠产生M蛋白抗体。当接种剂量为106PFU时,M蛋白抗体在接种后第一周变化不明显,而在第二周后开始显著上升,同时伴随着小鼠体重在接种后第一周非常显著的下降,而在第二周开始得到恢复,而M抗体也是在第二周开始有效产生;当接种剂量为103PFU则未产生高水平的抗体,而病毒也未对小鼠体重的影响也不明显。实验表明病毒抗体的产生与致病性的产生是有关系的,较低剂量的VSV不会导致小鼠的致病性,但也未有效产生抗体,这显示病毒未能有效复制,而高剂量时,导致显著的致病性,伴随着抗体也得到有效地激发。
同方学位论文库