低温诱导绵头雪莲愈伤组织蛋白质组学研究

作     者：金德善 

作者单位：北京林业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈玉珍

授予年度：2013年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：绵头雪莲 愈伤组织 双向电泳 蛋白质组 低温诱导 

摘      要：本研究采用西藏高原海拔4300-5280m地区生长的绵头雪莲(Saussurea. laniceps hand.-Mazz.)种子诱导的愈伤组织为研究对象,利用双向电泳和质谱鉴定技术,并结合生物信息学研究方法,研究了低温诱导条件下蛋白质表达丰度的变化,解析绵头雪莲的低温应答蛋白的功能,为揭示雪莲这种高寒地带特有高山植物的抗逆性机制提供实验依据。 由于高山植物生境特殊,雪莲积累的多酚、多糖及次生代谢物质等较丰富,这些物质会严重干扰双向电泳结果。在本研究中采用了三种蛋白质制备方法(TCA/丙酮法、尿素法、酚法),根据蛋白产量、蛋白纯度和电泳图谱对三种方法进行了比较,筛选出适宜雪莲愈伤组织蛋白制备方法为饱和酚抽提法。酚法提取的蛋白质干粉虽然少于TCA/丙酮法与尿素法,但蛋白质纯度可高达29%;SDS-PAGE检测结果表明,酚法提取的蛋白质条带数目较多,条带图谱较清晰;同时双向电泳图谱的蛋白点比TCA/丙酮法和尿素法多近60个点,且分辨率高,重复性好;酚法提取蛋白质样品经双向电泳上样量比较发现,17cm胶条500μg的上样量二维图谱背景和蛋白点分布较好,实验方法的建立为高山植物蛋白质组学研究奠定了基础。 本研究将绵头雪莲愈伤组织在0℃条件下分别进行了0h(对照)、12h、24h、48h、96h、192h的低温诱导,使用PDQuest8.0软件对得到的二维图谱进行分析,最终找到41个差异表达蛋白质,并进行了质谱鉴定。因为雪莲没有完成测序,其数据库信息不全,最后只得到了8个阳性结果,其中5个蛋白点上调表达,包括NADP依赖型异柠檬酸脱氢酶、耐受蛋白PRR8类蛋白、腺苷高半胱氨酸酶、一种源自水稻中的未知蛋白、微管蛋白α链;3个蛋白点下调表达,包括与DNA结合的含溴位点的蛋白、葡萄糖-6-磷酸异构酶和β微管蛋白。根据生物信息学分析,发现这些差异表达的蛋白与植物抗寒性有一定关联。最后我们通过UniProt数据库,将这41个蛋白质按其参与的生化过程分成了10大类,包括代谢相关蛋白(17.07%)、蛋白质合成相关蛋白(14.63%)、胁迫相关蛋白(9.76%)、转运相关蛋白(9.76%)、细胞结构相关蛋白(9.76%)、能量相关蛋白(7.32%)、光合作用相关蛋白(7.32%)、蛋白质降解相关蛋白(2.44%)、转录相关蛋白(2.44%)和未知蛋白(19.51%)。说明与代谢、蛋白质合成等相关的蛋白对绵头雪莲愈伤组织的抗寒性起到重要作用。