对羟基苯甲酸乙酯对雄果蝇的生殖毒性及其基于RNA-seq的DGE分析

作     者：赵晓俊 

作者单位：陕西师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：顾蔚

授予年度：2014年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 09[农学] 

主      题：果蝇 对羟基苯甲酸乙酯 生殖力 生殖毒性 RNA-seq DGE 

摘      要：对羟基苯甲酸酯类作为食用防腐剂已广泛应用于食品、药品、化妆品及各类儿童制品。由于其抗菌谱广、成本低、对酸碱较稳定等优点,一直以来被认为是一类安全、有效的防腐抗菌剂,然而有研究表明该类物质具有一定的雌激素效应,并且对生殖系统的损伤呈现剂量依赖效应。近年来研究发现乳腺癌样本中可以检测到该类物质的存在,而且能诱导乳腺癌细胞的增值,表明其还有一定的累积效应,对人体健康造成威胁。 RNA-seq技术是连接生物基因组信息与其功能蛋白质组的纽带。相对于全基因组信息而言,RNA-seq得到的序列不包含内含子和其它非编码的序列,在基因序列分析方面有着较高的优势。 本研究选取模式生物果蝇(Drosophila melanogaster, Canton-S品系)为实验材料,在生理水平上,检测对羟基苯甲酸乙酯(EP)3个不同浓度组(0.03%、0.07%、0.10%)处理雄果蝇,统计10d亲代(F0)和子一代(F1)产卵量及最大产卵量;F1和子二代(F2)羽化量和羽化率,以及卵-幼虫、幼虫-蛹、蛹-成蝇的天数和总羽化天数。在分子水平上,基于RNA-seq技术对0.07%EP组和对照组雄果蝇进行数字基因表达谱(DGE)分析,筛选两组果蝇的差异表达基因,对差异表达基因聚类分析、GO功能注释、EEG pathway分析,并以实时定量PCR验证DGE分析后两个上调基因和两个下调基因的表达趋势。 实验结果： ***组果蝇的各项生理指标与对照组相比差异显著,EP组F0果蝇的产卵量、羽化量及羽化率与对照组相比呈降低趋势,具有极显著差异(P0.01),F1总羽化天数也随着EP浓度的增加而延长。 2.经不同EP浓度处理F0雄果蝇,显示高浓度EP组(0.10%)F1产卵量和F2羽化量与对照组相比也具有极显著差异(P0.01),F2总羽化天数与对照组相比有所缩短,差异显著(P0.05),而0.03%和0.07%组均无显著差异。3.0.07%EP组雄果蝇与对照组DGE分析,筛选出18个显著差异表达基因。对差异表达基因GO功能分类,结果显示碳水化合物代谢过程、阳离子结合、水解酶活性、粒子结合所富集的差异表达基因数目较多,分别占主导地位。此外,在生物学进程、细胞组分和分子功能类别中,分别有一个(甘露糖代谢过程)、两个(裂解泡与溶酶体)和四个(α-甘露糖苷酶的活性、甘露糖苷酶活性、水解酶活性,水解的O-糖基化合物、水解酶活性,糖基键作用)显著性富集的term(p0.05)。 4.对上调和下调基因GO分析显示,细胞组分中全为下调的基因,而生物学进程与分子功能中上下调基因都存在,其中生物学进程与碳水化合物代谢相关的下调基因数目较多,与氧化应激反应相关的上调基因数目较多,而分子功能中与水解酶活性、α-甘露糖苷酶活性、糖基键作用、甘露糖苷酶活性和结合碳水化合物相关的只有下调基因,且富集的数目较多,与肽酶活性和羧肽酶活性相关的只有上调基因,其余的结合锌离子、阳离子、过渡金属离子、金属离子、离子和水解酶活性相关的既有上调基因也有下调基因。 5.通过KEEG分析差异表达基因的pathway途径,得出这些基因主要富集于8个pathway,其中有淀粉和蔗糖代谢、磷脂酰肌醇信号系统、代谢途径、溶酶体、磷酸肌醇代谢、谷胱甘肽代谢和半乳糖代谢7个显著富集的pathway。 6.对筛选出的18个差异表达基因,选取4个基因(两个上调和两个下调)经实时定量PCR验证,结果显示这四个基因的表达趋势与基于RNA-Seq的DGE分析结果一致。. 综合各项分析表明EP对F0雄性果蝇具有一定的生殖毒性,而高浓度EP对F0的影响可持续至子代。推测EP会引起果蝇体内代谢、激素分泌、基因表达紊乱以及与各种酶的功能相关基因表达的改变,可能影响到雄果蝇生殖,对机体存在一定的毒性。