三种菠萝凋萎相关病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

作     者：胡加谊 

作者单位：海南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：何凡

授予年度：2014年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

主      题：PMWaV-1 PMWaV-2 PMWaV-3 菠萝凋萎病 TaqMan探针 实时荧光定量RT-PCR 检测方法 

摘      要：菠萝凋萎相关病毒(Pineapple mealybug wilt associated virus, PMWaV)为长线形病毒科(Closteroviridae)葡萄卷叶病毒属(Ampelovirus)的正向单链RNA病毒。目前在世界范围内已报道了五种PMWaVs。由PMWaV-2和菠萝粉蚧共同危害引起的菠萝凋萎病(Mealybug wilt of pineapple, MWP)是世界各菠萝主产区的重要病害之一,对菠萝经济栽培造成严重影响。有国内学者报道,菠萝凋萎病发病率可高达60%,造成25-30%的经济损失。在夏威夷大学主导下,PMWaVs在形态特征与分类地位、基因组结构和检测方法等方面的研究均取得很大进展。尽管国内外的学者针对PMWaVs建立了电镜检测、ELISA、组织免疫印迹和普通RT-PCR等检测方法,但关于PMWaVs实时荧光定量RT-PCR检测方法的研究少见报道,针对PMWaVs常出现的复合侵染现象建立多重实时荧光定量RT-PCR检测方法也未见报道。本研究针对目前在我国已见报道的PMWaV-1,2,3三种菠萝凋萎相关病毒,以海南省农业科学院热带果树研究所科研基地和海南省澄迈县福山镇果园菠萝凋萎病阳性的菠萝样品为对象,针对靶标病毒序列的保守区域分别设计特异性引物和TaqMan探针,通过制备重组质粒标准品构建标准曲线,建立并优化了PMWaV-1,2,3三种病毒的单重和三重实时荧光定量RT-PCR检测方法,为菠萝凋萎相关病毒的快速定量检测提供了技术支持。具体内容为： 1)针对PMWaV-1,单重实时荧光定量RT-PCR检测方法的标准曲线为y=-3.307*log(x)+38.18,扩增效率为100.6%,相关系数R2为0.998。实验结果表明,该方法对PMWaV-1最低检测限达到4个拷贝,比普通RT-PCR高出10倍;2)针对PMWaV-2,单重实时荧光定量RT-PCR检测方法的标准曲线为Y=-3.267*log(x)+43.33,扩增效率为102.3%,相关系数R2为0.997。实验结果表明该方对PMWaV-2的最低检测限为6个拷贝,检测灵敏度比普通RT-PCR高出10倍;3)针对PMWaV-3,单重实时荧光定量RT-PCR检测方法的标准曲线为Y=-3.160*log(x)+38.04,扩增效率为107.2%,相关系数R2为0.992。实验结果表明该方可特异地检测出PMWaV-3,对PMWaV-3的最低检测限为303拷贝;4)重复性实验表明建立的单重实时荧光定量RT-PCR检测方法批内和批间变异系数均小于2%,所建立的方法操作简便、特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于三种目标病毒的定量检测;5)根据PMWaV-1,2,3三种病毒CP基因序列的保守区域,分别设计特意性引物和携带不同荧光标记的TaqMan探针,在优化三重实时荧光定量RT-PCR后建立的三重标准曲线,其中PMWaV-1的标准曲线为7=-3.283*log(x)+39.02,扩增效率为101.7%,线性相关系数R2为0.999;PMWaV-2的标准曲线为Y=-3.393*log(x)+37.53,扩增效率为97.1%,线性相关系数R2为0.998;PMWaV-3的标准曲线为Y=-3.171*log(x)+38.48,扩增效率为106.7%,线性相关系数R2为0.996。这表明PMWaV-1,2,3三种病毒质粒标准品在同一反应体系中能得到稳定的扩增,且线性关系良好,可用于后续试验。重复性实验表明三重实时荧光定量RT-PCR扩增曲线的标准差均小于0.26,变异系数均小于1.44%;灵敏度实验表明三重实时荧光定量RT-PCR检测方法对PMWaV-1的最低检测限为99拷贝,对PMWaV-2最低检测限为98拷贝,对PMWaV-3的最低检测限为868拷贝。这表明本研究建立的三重实时荧光定量RT-PCR检测方法是能够快速、灵敏、稳定地定量检测PMWaV-1,2,3三种病毒。