石家庄地区结核分枝杆菌临床分离株基因分型及耐药性分析

作     者：张志 

作者单位：河北医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：金玉怀;戴二黑

授予年度：2015年

学科分类：1002[医学-临床医学] 1010[医学-医学技术（可授医学、理学学位）] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：结核分枝杆菌 基因分型 数目可变串联重复序列分析 间隔区寡核苷酸基因分型 

摘      要：目的:对石家庄地区结核分枝杆菌临床分离株进行基因分型研究和药物敏感性试验,分析了石家庄地区结核分枝杆菌基因多态性和分子流行病学特征,及石家庄地区结核分枝杆菌临床分离株的耐药情况以及耐药菌株基因分型特征,有助于对石家庄地区结核病的流行发展趋势的充分了解,为结核病的有效防治提供科学依据。方法:收集2014年1月至2014年10月期间在石家庄市第五医院就诊的结核病患者经临床分离培养得到的结核分枝杆菌菌株及相应病例背景资料,采用PNB/TCH初步鉴别法和多位点PCR(Multi-locus PCR)进行菌种鉴定。采用比例法进行一线抗结核药(链霉素、异烟肼、利福平、乙胺丁醇)的药物敏感性试验。应用间隔区寡核苷酸基因分型(Spoligotyping)和15位点数目可变串联重复序列分析(VNTR)进行菌株的基因分型。运用Bio Numerics 5.0软件进行聚类分析,运用SPSS16.0软件进行Hunter-Gaston分辨指数(HGDI)计算和卡方检验(计数资料)、t检验(计量资料)等数据分析。结果:1收集到石家庄地区结核分枝杆菌培养阳性共373株,经过PNB/TCH和多位点PCR实验证实为结核分枝杆菌有367株和非结核分枝杆菌6株。2间隔区寡核苷酸基因分型法(Spoligotyping)367株结核分枝杆菌呈现明显的基因多态性。通过比对Spol DB4.0数据库,可分为2个基因群,即北京家族(Beijing family)和非北京家族(Non-Beijing family),分别占91.3%(335/367)和5.7%(21/367)。有11株(3.0%)的基因型不能被Spol DB4.0数据库所识别,可能为新的基因型。北京家族菌株中99.4%(333/335)为典型北京家族(Typical Beijing family),表现为仅与35～43之间的9个间隔区呈现阳性杂交反应;其余菌株在35～43之间有1～4个位点呈现阴性杂交反应,称为非典型北京家族(Atypical Beijing family)或北京样基因型(Beijing-like family)。非北京家族菌株表现出高度的基因多态性,包括T基因型,占66.7%(14/21);MANU基因型,占14.3%(3/21);LAM基因型,占14.3%(3/21);H基因型,占4.7%(1/21)。经Bio Numerics软件聚类分析,全部29种基因型包含10个簇和147种独特基因型(单一菌株类型)。其中最大的一个簇含331株(90.2%),为北京家族基因型。Spoligotyping对所有菌株的HGDI值为0.2486。3数目可变串联重复序列分析(VNTR)经Bio Numerics软件聚类分析,367株结核分枝杆菌可分为194种VNTR基因型,其中221(60.22%)株菌可被聚类为48个簇,146(39.78%)种基因型为独特基因型;335株北京家族菌株呈现161种VNTR基因型,其中219(65.37%)株可聚为45个簇,116(34.63%)为独特基因型。VNTR对所有菌株的HGDI值为0.9838,VNTR和Spoligotyping联合使用时,HDGI值为0.9853。4石家庄地区2014年结核分枝杆菌的总耐药率为31.61%(116/367),其中初始耐药率为24.47%(69/282),获得性耐药率为55.29%(47/85)。获得性耐药率明显高于初始耐药率,差异有统计学意义(χ2=28.71,P0.05)。结论:1石家庄地区结核分枝杆菌的基因型存在明显的多态性,其最主要流行菌株是北京家族型,发现了11株新的Spoligotyping基因型,可进一步完善Spoligotyping数据库的菌株信息。2 VNTR-15基因分型法的分辨能力高于Spoligotyping基因分型法的分辨能力,联合使用VNTR-15和Spoligotyping的分辨能力更高。提示联合采用Spoligotyping和VNTR这两种分型方法能够全面分析结核分枝杆菌的基因多态性。本研究采用的15个VNTR位点适合石家庄地区结核分枝杆菌基因分型研究。3石家庄地区2014年结核分枝杆菌的总耐药率和初始耐药率与全国平均水平持平,但获得性耐药率处于较高水平。提