Choukroun's PRF对体外培养人脂肪干细胞增殖及成骨分化影响的实验研究

作     者：刘元媛 

作者单位：南方医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：柳大烈

授予年度：2013年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100101[医学-人体解剖与组织胚胎学] 10[医学] 

主      题：Choukroun’s 富血小板纤维蛋白(Choukroun’s PRF) 脂肪来源干细胞(ADSCs) 体外培养 细胞增殖 成骨分化 

摘      要：一、研究背景 国内外许多研究已经证明血小板浓缩物被激活后可释放出多种细胞生长因子,如：血小板衍化生长因子AB(PDGF-AB)、内皮细胞生长因子(ECGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子β(TGF-β)、类胰岛素生长因子(IGF)等。这些因子对细胞生长分化和组织修复再生有重要的作用。1984年,Assion最早从人血浆中提取出富血小板血浆(platelet-rich plasma, PRP),1987年,Ferrari等将PRP首先运用于心胸外科,随后由于发现PRP释放出的生长因子可以增强组织修复和再生,广泛应用于整形外科和创伤外科等领域。但由于PRP在制备过程中添加了异种凝血酶和抗凝剂,存在免疫排斥反应和感染性疾病传播的危险,其应用一直存在争议。 2000年,法国学者Choukroun等第一次制备提取了新一代血小板浓缩制品即富血小板纤维蛋白(Choukroun’s platlet-rich fibrin,Choukroun’s PRF),其保留了上一代血小板浓缩制品PRP的优点,同时兼具制备过程简单、完全取自于自体血、无需添加任何生物制剂、成骨能力强等特点,制备简单且经济,避免了血液交叉感染的风险以及伦理道德的争议。因此PRF被认为是一种最佳的天然血液凝集物。大量研究表明Choukroun’s PRF在口腔颌面外科、骨科和整形美容科有潜在的临床使用价值,比如其可以缩短创伤组织的愈合时间,促进骨组织的移植重建,加速美容手术后的修复。但目前Choukroun’s PRF的研究还处于初级阶段,还需要进一步的研究和探讨。 在临床上,由于创伤、感染、肿瘤、畸形等造成的骨缺损非常常见,但骨组织的修复及再生是十分困难的,近几十年来,随着组织工程技术的发展,生物材料的更新,骨组织工程的发展已经成为骨缺损修复的新思路,是解决大块骨缺损等临床难题的较理想方法。而骨组织工程的种子细胞来源制约了骨组织工程进一步的应用。理想的种子细胞来源应具备：来源丰富,取材方便及对机体损伤小;有较强的增殖及传代能力;取自自体组织,移植后不存在免疫排斥反应;植入体内后能高质量的修复骨缺损,并保持良好的远期观察疗效。骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)具有增殖和多向分化的能力,已经广泛用于研究,但其不容易获取,成骨分化能力有限,成为骨组织工程的种子细胞具有局限性。 自Zuk等首次从吸脂术抽取的脂肪组织中分离出脂肪来源间充质干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)以来,体外培养的脂肪干细胞表现出与骨髓间充质干细胞(BMSCs)有类似的分化能力,在体外诱导分化实验中,加入不同的化学试剂和细胞因子,可以诱导ADSCs分化形成脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、心肌细胞、神经细胞、内皮细胞和肝细胞等。而且脂肪干细胞具有易获取、可迅速扩增及生长迅速的特点。由于其具有以上优点,近年来对其研究很多,ADSCs是一类具有广阔应用前景的成体干细胞,为组织工程技术提供了良好的细胞来源,但由于其作为成体干细胞仍然存在很多值得进一步研究的问题。但其成骨分化能力有限,制约了其在骨组织工程中的运用。 二、研究目的 本实验研究是体外培养人脂肪干细胞(ADSCs)后,给予自体富血小板纤维蛋白(Choukroun’s PRF)干预,并与对照组进行对比,观察自体富血小板纤维蛋白(Choukroun’s PRF)对人脂肪干细胞(ADSCs)增殖及成骨分化能力的影响,探讨一种可能增强脂肪干细胞增殖及成骨分化的技术,为骨组织工程的种子细胞提供一种新的技术和思路。 三、方法 1.实验组织来源：所用脂肪来自于成人腹部脂肪抽脂术和骨科大腿手术获得的脂肪组织,供体共8位,为20～40岁患者,为2位珠江医院整形外科和6位骨科的就诊患者,无传染病及内分泌疾病,无长期服用药物史。静脉血来自相应脂肪来源的对应患者。 2.体外培养人脂肪干细胞,实验所用的细胞为第3代细胞。 3.人脂肪干细胞的鉴定：分别向骨细胞、脂肪细胞、神经球细胞定向诱导分化鉴定,并行细胞表面抗原CD29、CD45、CD90流式检测鉴定。 4.采用Choukroun法制备富血小板纤维蛋白(PRF)。 5.实验分组：本实验将普通细胞培养基中加入PRF与否,分为PRF组Ⅰ和对照组Ⅰ,并选择4个时间点(1d、3d、5d、7d)分别对比观察两组细胞增殖情况;成骨诱导培养基中加入PRF与否,分为PRF组Ⅱ和对照组Ⅱ,同样选择4个时间点(7d、14d、21d、28d),对比观察各时间点脂肪干细胞成骨诱导情况,并以不含PRF的普通细胞培养基组作为空白对照。每组样本量3-4例。 ***-8比色法制作标准曲线,检验测得的OD值与人脂肪干细胞数量之间的相关性。 ***-8试剂盒