烷烃降解菌的代谢和2-苯基丙酸的生物催化

作     者：左可 

作者单位：华东理工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李志敏

授予年度：2013年

学科分类：081702[工学-化学工艺] 081703[工学-生物化工] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 0836[工学-生物工程] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 

主      题：红球菌 P450单加氧酶 异丙苯 2-苯基丙酸 生物催化 

摘      要：Rhodococcus sp.G2和Rhodococcus sp. G14是能高效快速降解烷烃的红球菌菌株。当Rhodococcus sp. G2以正十二烷和葡萄糖同时为碳源时,其代谢与一般细菌表现有所不同。正十二烷浓度与葡萄糖浓度分别为7.5g/L和6.8g/L时,Rhodococcus sp.G2始终以正十二烷为唯一碳源代谢,OD600在25h时达到5.31。降低正十二烷浓度为1.5g/L,Rhodococcus sp.G2优先利用正十二烷,15h正十二烷消耗完全,菌体OD600达到1.0,后经过一段时间的间歇,再以葡萄糖为碳源进行生长,整个生长过程表现出一种“二次生长现象。 Rhodococcus sp.G14全细胞能催化异丙苯生成2-苯基丙酸,优化后培养基中碳源正十二烷浓度为18.75g/L,氮源乙酸铵浓度为0.5g/L,吐温80浓度为0.01%V/V时,菌体浓度OD600能够达到20;其细胞经过1%V/V吐温80渗透处理10min后,在温度25℃,菌体浓度OD600为4.0,底物浓度8.63g/L,反应时间48h时,2-苯基丙酸达到14.3mg/L。克隆表达Rhodococcus sp.G14中的P450单加氧酶,构建了重组菌Escherichia coli BL21/pET43.1a-P450,并利用重组细胞催化异丙苯生产2-苯基丙酸。经响应面优化,在底物浓度为8.63g/L,pH7.7,OD600为6.16,葡萄糖浓度为5g/L,Tween80为1%V/V,NADPH为7.5mM,反应温度为30℃,反应时间为4.4h时,可以得到2-苯基丙酸45.9mg/L,优化后的E. coli BL21/pET43.1a-P450生产2-苯基丙酸产量为野生菌Rhodococcussp.G14的3倍。