牛的三种泰勒虫MPSP基因的克隆表达及牛泰勒虫病通用ELISA方法的建立

作     者：赵帅阳 

作者单位：中国农业科学院 

学位级别：硕士

导师姓名：罗建勋

授予年度：2014年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：牛泰勒虫 MPSP Western-blot ELISA 血清学调查 

摘      要：牛泰勒虫病是由泰勒虫属的原虫寄生于牛的网状内皮细胞和红细胞内所引起的蜱传性血液原虫病,以发热、贫血、黄疸及体表淋巴结肿大为典型特征,呈全球性分布,其中小泰勒虫和环形泰勒虫是致病性最强的两种病原。在我国,已报道的有环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫和中华泰勒虫三种病原。环形泰勒虫的媒介蜱为残缘璃眼蜱、小亚璃眼蜱和盾糙璃眼蜱,瑟氏泰勒虫的媒介蜱主要是长角血蜱,中华泰勒虫的媒介蜱为青海血蜱。本研究以主要梨浆虫表面膜蛋白(Major Piroplasm Surface Protein, MPSP)为研究对象,以原核表达系统对环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫和中华泰勒的MPSP分别进行表达,对其重组蛋白的反应原性和特异性进行分析,并通过优化表达条件提高重组蛋白的表达量,最后选择中华泰勒虫MPSP重组蛋白为抗原建立了牛泰勒虫病的通用ELISA诊断方法,并对我国部分地区1936份血清进行流行病学调查。研究内容如下： 1.下载Gene Bank中已有的泰勒虫MPSP基因序列,对其抗原表位进行生物信息学分析发现,三种病原抗原表位分布非常相似,很难通过截断表达实现特异性诊断的目标;根据已报道的序列,分别设计针对环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫和中华泰勒虫的特异性引物,以其各自的基因组DNA为模版,扩增3种泰勒虫的MPSP基因,经测序验证后,用原核表达系统进行表达,实验发现,这3种泰勒虫的重组蛋白均能与其他两种牛泰勒虫阳性血清反应,但与牛和羊的巴贝斯虫以及羊无形体阳性血清没有交叉反应,说明该蛋白表现为泰勒虫属特异性 2.以纯化的中华泰勒虫MPSP重组蛋白为抗原建立了牛泰勒虫间接ELISA方法,对其反应条件进行了优化,敏感性和特异性分别达到100%和95.7%,对来自新疆、辽宁和吉林共242份野外样品进行评估,其阳性率分别为23.1%(25/108)、56.1%(46/82)和67.3%(35/52)。 3.以所建立的间接ELISA方法对我国陕西、青海、新疆、西藏、甘肃、河北、河南、辽宁、吉林和内蒙古10个省份的1936血清进行了检测,抗体阳性率在23.1%-67.3%之间,并结合媒介蜱的自然地理分布情况,对这些地区牛泰勒虫病的流行情况进行了讨论。