环丙沙星体外诱导对铜绿假单胞菌QS基因调控影响的研究

作     者：高雅婷 

作者单位：山西医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：段金菊

授予年度：2018年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100706[医学-药理学] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：铜绿假单胞菌 群体感应系统 毒力因子 环丙沙星 PQS 

摘      要：目的:本研究通过不同浓度的环丙沙星对敏感的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginoisa,PA)进行体外诱导,探讨不同的浓度及诱导时间对铜绿假单胞菌耐药性、毒力因子和群体感应(quorum sensing,QS)相关基因的影响,进而探索环丙沙星在诱导过程中是否参与了QS对毒力因子的调控,为临床合理使用喹诺酮类药物提供依据。一、环丙沙星体外诱导对铜绿假单胞菌耐药性的影响方法:1.实验菌株的选择:将课题组前期收集的2012013年临床分离的铜绿假单胞菌非重复性菌株40株经VITEK-2重新鉴定,通过测定菌株对环丙沙星的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentrations,MICs),筛选出对环丙沙星敏感的菌株,最后选择其中来源于无菌体液和伤口分泌物的菌株与PAO1一起组成本研究的实验菌株。2.环丙沙星体外诱导实验:根据各实验菌株对环丙沙星的MICs值,将各菌株分别接种于相应的0.5×MIC,1×MIC,2×MIC和4×MIC四个浓度的含环丙沙星琼脂培养皿中,共传代培养5天,其中诱导1天时的菌株定义为1代菌,诱导2天则定义为2代菌,依次类推。分别保存其中1、3、5代菌株备用。3.耐药性的测定及统计分析:采用琼脂倍比稀释法测定所有保存的菌株对环丙沙星的MICs,统计不同诱导浓度及不同时间的耐药率变化。MICs经lg转化后采用重复测量方差分析的方法研究不同浓度的环丙沙星诱导5代对铜绿假单胞菌MICs的影响。P2×MIC0.5×MIC1×MIC。二、环丙沙星体外诱导对铜绿假单胞菌毒力因子的影响方法:1.泳动能力:用接种针挑取单个菌落插入胰蛋白胨泳动平板上,32℃培养16h,测量浑浊圈直径。所有诱导前后的菌株均重复三次实验。2.绿脓菌素:采用双向萃取法(氯仿与盐酸)测定绿脓菌素的活性,取OD520/OD600表示绿脓菌素活性。所有诱导前后的菌株均重复三次实验。3.统计分析:采用重复测量方差分析的方法研究不同浓度的环丙沙星诱导5代对铜绿假单胞菌毒力因子(泳动能力,绿脓菌素)的影响。单因素分析方法根据资料的正态性选择t检验或Kruskal-Wallis秩和检验。结果:1.泳动能力:经重复测量方差分析,诱导时间与诱导浓度的交互作用无显著差异(P=0.157),即随诱导时间延长,各浓度的泳动能力变化趋势相同。主效应诱导时间之间差异显著(P0.001),即随诱导时间延长铜绿假单胞菌泳动能力先抑制后促进。诱导浓度之间无明显差异(P=0.910),但单效应分析结果显示,0.5×MIC和1×MIC浓度的环丙沙星随时间抑制作用逐渐减弱,促进作用逐渐增强;而2×MIC和4×MIC只有促进作用,且随时间变化不明显。研究还发现,诱导1天时各浓度对铜绿假单胞菌的泳动能力均有弱的抑制作用;诱导3天时各浓度均有弱的促进作用;到第5天,各诱导浓度的促进作用有所差别,其中0.5×MIC最强,4×MIC最弱。2.绿脓菌素:经重复测量方差分析,诱导时间与诱导浓度的交互作用无显著差异(P=0.528),即随诱导时间延长,各浓度的绿脓菌素变化趋势相同。主效应诱导时间之间无差异显著(P=0.404),诱导浓度之间亦无明显差异(P=0.901),即环丙沙星各浓度对铜绿假单胞菌