马铃薯StGID1b基因表达载体构建及其遗传转化

作     者：赵仕荣 

作者单位：甘肃农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：司怀军

授予年度：2018年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：马铃薯 StGID1b TATC-Box GID1s Gateway克隆技术 酵母单杂交技术 

摘      要：GID1(Gibberellin insensitive dwarf1,GID1)是赤霉素(GA)信号传导途径中的受体蛋白,是该途径的关键因子之一。拟南芥中发现了三类编码该蛋白的基因,分别是:GID1a、GID1b和GID1c。GID1基因在多种被子植物中已经被克隆,但是在马铃薯中的报道较少。为研究GA在马铃薯休眠中的作用,本文克隆了11个马铃薯GID1s家族基因(StGID1-1～10和StGID1b);氨基酸序列分析表明,马铃薯GID1蛋白StGID1-1～10和StGID1b存在家族保守结构域;qRT-PCR(Real time quantitative PCR,实时荧光定量聚合酶链式反应)分析表明,StGID1-1～10和StGID1b基因在马铃薯块茎不同储藏时间中表达水平有差异;采用农杆菌介导法获得转基因马铃薯StGID1b。本研究取得的结果如下:1.以马铃薯数据库中11个GID1s家族基因核苷酸序列为探针,在NCBI中进行BLAST比对获得同源序列,通过系统发育分析,该家族基因与番茄和辣椒的同源性较高;对该家族基因进行生物信息学分析,鉴定出11种GID1s基因集中于1、6、9、11和12号染色体。***-PCR分析表明,在不同的时间段(0、20、50、61和78 d),StGID1-1～10和StGID1b基因在马铃薯块茎中表达水平有差异,其中StGID1-b、StGID1-4、StGID1-6在马铃薯块茎中上调表达,StGID1-8、StGID1-10在马铃薯块茎中下调表达,而StGID1-b基因的上调程度较为明显。3.选取上调程度最为明显的StGID1-b基因构建了其过表达载体pCPB-StGID1b,并用Gateway克隆技术构建了其干扰表达载体pHellsgate8-StGID1b,采用农杆菌介导法转化马铃薯栽培品种“陇薯3号获得了转化植株,通过PCR鉴定分别获得了4株和5株转基因植株。4.通过对StGID1-b基因的启动子区上游3000 bp进行分析,获取该基因启动子区部分功能顺式作用元件;通过对TATC-box顺式作用元件的串联重复,构建了诱饵载体pHis2.1-4TATC-box;利用酵母单杂交技术对TATC-Box与StGID1b基因的互作进行预测,结果表明TATC-Box与StGID1b可以互作。