YAP1促进前列腺癌EMT表型及机制研究

作     者：晏滨 

作者单位：天津医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：牛远杰

授予年度：2016年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：Yes 相关蛋白 1 前列腺癌 上皮-间质转化 雄激素受体 表型 核移位 

摘      要：目的:通过测定人前列腺疾病患者不同阶段前列腺组织的YAP1及EMT靶标的蛋白水平以及相关的细胞和动物实验,重点研究YAP1对于前列腺癌发生EMT的影响以及对其发生机制作初步探讨。方法:1、对从良性前列腺增生到去势抵抗性前列腺癌患者的组织标本进行免疫组织化学染色,检测YAP1、E-Cadherin和N-Cadherin的表达水平并对三种蛋白水平差异进行分析比较。2、通过细胞实验,沉默YAP1基因,进行划痕实验并观察细胞迁移生长情况;其次,进行YAP1基因沉默和过表达,比较处理后的前列腺癌细胞中YAP1、E-Cadherin和Vimentin的表达差异;再次,双氢睾酮和恩杂鲁胺处理后检测AR、YAP1、磷酸化Smads表达差异及相互关系并对上述细胞进行细胞核和细胞质蛋白分离,分别对胞核和胞质蛋白进行上述三个指标的比较分析;最后,用TGF-β处理细胞后观察YAP1表达及细胞表型转变。3、通过动物实验,验证上述实验的动物体内影响并研究YAP1的抑制剂维替泊芬对异种移植肿瘤生长、肿瘤内YAP1表达及肿瘤EMT表型的影响。结果:1、免疫组化结果显示YAP1和N-Cadherin在BPH,L-ADPC,H-ADPC,ADT以及CRPC组织中表达量及阳性细胞数均依次升高,而E-Cadherin在五个疾病阶段显示出降低趋势。2、划痕实验结果显示在C4-2细胞中,敲除YAP1后细胞在培养24h后迁移距离显著缩短,差异具有统计学意义(P0.05);在C4-2细胞中,沉默YAP1之后E-Cadherin表达显著升高,Vimentin表达显著降低;反之,过表达YAP1之后,E-Cadherin表达显著降低,Vimentin表达量显著升高;在LNCaP细胞中,对DHT处理及DHT+MDV3100处理,胞浆中未见AR、YAP1及P-Smads三个指标的显著性改变;然而在细胞核中,MDV3100处理后,胞核内的AR显著减少,YAP1显著增高,以及P-Smads升高明显;在C4-2细胞中,si5YAP1沉默YAP1效果良好,control+TGF-β组与control组对比,表明TGF-β显著促进YAP1基因转录,差异具有统计学意义。3、在BALB/c裸鼠皮下种植C4-2细胞,敲除YAP1的瘤体较小并且未见明显肿瘤转移;将正常C4-2细胞种植于小鼠皮下,VP药物实验组小鼠瘤体显著小于DMSO对照组;对上述肿瘤进行免疫组化,发现VP药物组YAP1表达量减低,E-Cadherin表达升高显著,N-Cadherin表达降低明显;Brdu实验显示VP药物组肿瘤增殖较少,而DMSO对照组肿瘤增殖旺盛,差异具有统计学意义;在BALB/c裸鼠皮下种植LNCaP细胞,进行手术去势,发现随着手术去势时间的延长,YAP1蛋白表达逐渐增多,E-Cadherin表达逐渐减少并且N-Cadherin表达量也呈现增多趋势。结论:该研究初步证实YAP1能够促进前列腺癌EMT表型改变,能够增强细胞迁移能力。其机制可能是随着AR功能异常或正常AR水平减低,YAP1逐渐激活并促进Smads磷酸化,二者一起协同进入细胞核,除此之外,经典的TGF-β也可以促进YAP1的上述作用。最后,VP药物能够抑制YAP1对前列腺肿瘤细胞促EMT转变及其安全性尚可;总之,通过初步的探索,探究出部分信号通路或PCa EMT发生发展机制,在预防和治疗CRPC甚至mCRPC方面,YAP1也许会有很好的应用前景。