人参皂苷Rh2对实验性子宫内膜异位症的治疗作用和机制探讨

作     者：盛磊 

作者单位：复旦大学 

学位级别：硕士

导师姓名：朱焰

授予年度：2013年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100211[医学-妇产科学] 10[医学] 

主      题：人参皂苷Rh2 子宫内膜异位症 动物模型 细胞模型 细胞凋亡 细胞增殖 蛋白芯片 双酚A Bcl-2 Bax Caspase-9 Caspase-3 pp38 pSrc EMAb 雌二醇 孕酮 双重作用 蛋白表达 拮抗剂 sB203850 PP2 

摘      要：目的： 通过构建子宫内膜异位症的体内、体外模型,研究人参皂苷Rh2对实验性子宫内膜异位症的治疗作用,并探讨人参皂苷Rh2对子宫内膜异位症的作用机制。 方法： 1.大鼠适应性饲养一周后,阴道涂片,记录动情间期的变化,选取动情周期规则的SD大鼠进行造模实验,采用外科自体移植法构建SD大鼠子宫内膜异位症模型,术后恢复三周后开腹探查子宫异位内膜生长状况。 2.造模成功的SD大鼠随机分为五组,分别为模型对照组(0.5%CMC-Na)、阳性对照组(孕三烯酮1.5mg/kg)、Rh2低、中、高剂量组(5mg/kg、10mg/kg、40mg/kg)。在连续灌胃给药21天后再次开腹,测量异位内膜长宽高并计算其体积。 3. EMs模型SD大鼠解剖后腹主动脉取血,酶联免疫法(ELISA)测定大鼠体内的雌二醇(E2)、孕酮(P)和抗子宫内膜抗体(EMAb)水平,HE染色观察异位内膜病理组织学改变,Western blot法测定各组动物移植异位内膜的Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9表达的变化。 4. EMs患者的子宫内膜组织经Ⅱ胶原酶消化后,过筛后人子宫异位内膜细胞进行体外培养,建立人子宫内膜异位症的体外细胞模型。 5.用无酚红DMEM/F12培养液(含10%活性炭吸附FBS)培养人子宫异位内膜细胞,用不同浓度的Rh2(0.0001-100μmol/L)作用于离体培养的人子宫异位内膜细胞24h、48h和72h,分析人参皂苷Rh2对人子宫异位内膜细胞生长的影响。 6.采用R&D蛋白芯片检测溶剂对照组(DMSO)和Rh2(30μmol/L)组磷酸化蛋白激酶表达的差异,筛选出主要的差异性表达激酶,并用Real-time RT-PCR技术验证蛋白芯片的结果,研究人参皂苷Rh2对人子宫异位内膜细胞磷酸化激酶的影响。 7.利用Western blot技术检测溶剂对照组(DMSO)和Rh2(30μmol/L)组蛋白表达差异性(pp38,pSrc,Bcl-2,Bax等),并比较存在特异性拮抗剂下,各蛋白水平表达的差异。 结果： 1.在连续给予21天0.5%CMC-Na、孕三烯酮(1.5mg/kg)和不同剂量Rh2后,模型对照组异位内膜体积明显增大,而孕三烯酮组和人参皂苷Rh2低、中、高剂量组(5,10、40mg/kg)异位内膜生长受到抑制,异位内膜体积减小。人参皂苷Rh2(40mg/kg)能显著抑制大鼠子宫异位内膜的生长(P0.05)。 2. ELISA法测定给予不同剂量人参皂苷Rh2后的EMs大鼠血清中E2、P和EMAb水平,发现血清中E2、P和EMAb水平水平随着人参皂苷Rh2剂量的加大而降低,其中人参皂苷Rh2(40mg/kg)显著降低E2、P和EMAb水平(P0.05)。提示了人参皂苷Rh2抑制异位内膜的生长与E2、P和EMAb水平降低有关。 3.人参皂苷Rh2(5.10、40mg/kg)能增加异位内膜组织中Bax/Bcl-2、Caspase-9和Caspase-3蛋白的表达,提示了人参皂苷Rh2通过上调Bax/Bcl-2、 Caspase-9和Caspase-3的表达来诱导凋亡。 4.人参皂苷Rh2对人子宫异位内膜细胞具有正性和负性双重作用,表现为低浓度(0.0001～1μmol/L)时有促进增殖的作用,高浓度(10μmol/～100μmol/L)时有抑制生长的作用。 5. BPA(0.01μmol/L)和BPA (0.0001μmol/L)能促进人子宫内膜细胞的增殖,增殖率可分别达16%和12%。在BPA (0.01μmol/L)存在时,Rh2(3、10、20和30μmol/L)对人子宫异位内膜细胞抑制作用更显著(P0.05)。 6.人参皂苷Rh2(30μmol/L)可上调人子宫异位内膜细胞磷酸化蛋白激酶Src(Y419)的表达,下调磷酸化蛋白激酶JNK pan(T183/Y185、T221/Y223)、 GSK-3α/β (S21/S9)、p-catenin、ERK1/2(T202/Y204, T185/Y187)、MSK1/2(S376/S360)的表达。进一步分析结果显示,磷酸化蛋白激酶差异性表达主要涉及Src及MAPK通路。 7.当Src/p38MAPK通路受到抑制时,人参皂苷Rh2能增加Bax/Bcl-2的表达,提示了人参皂苷Rh2抑制人子宫异位内膜细胞生长可能与抑制Src/p38MAPK通路有关。 结论： 1.首次发现天然产物单体人参皂苷Rh2(40mg/kg)能显著抑制异位子宫内膜的生长,有希望用于治疗子宫内膜异位症。 2.人参皂苷Rh2抑制实验性异位内膜的生长可能与降低E2、EMAb和P的水