不同细胞滋养层对人角朊细胞体外培养的影响
作者单位：第四军医大学
学位级别：硕士
导师姓名：冯光珍
授予年度：2004年
学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100101[医学-人体解剖与组织胚胎学] 10[医学]
摘 要：目前，在烧伤创面治疗中取自体皮片移植仍是最主要的方法，对于大面积烧伤患者来说自体皮源远远不能满足临床需求，组织工程技术的发展使体外培养人表皮细胞的技术不断得以完善，自体皮肤(主要是角朊细胞)体外快速扩增为烧伤治疗提供了广阔的前景。经典的角朊细胞培养方法以放射线处理的3T3细胞作为滋养层，以FAD作为培养基，角朊细胞体外培养周期一般需要2周，不能及时满足临床需要。本实验研究的目的即对传统的人角朊细胞体外培养方法进行研究及改进，利用丝裂霉素处理的3T3细胞和人成纤维细胞分别作为滋养层，比较人角朊细胞在两种细胞滋养层上体外培养融合的周期，以期找到能使人皮肤角朊细胞体外培养更快融合的培养体系。探索和寻找人角朊细胞体外培养适宜的滋养层细胞，完善人角朊细胞体外培养快速扩增的技术和方法。 本实验分别在3T3细胞、原代培养的人成纤维细胞上接种原代人角朊细胞，并设无滋养层细胞的空白对照。通过角朊细胞在不同滋养层上贴壁生长及融合时间的观察，确定适合角朊细胞生长的最佳细胞滋养层。在对不同滋养层细胞的处理上分别采用了钴60放射线照射的传统方法和丝裂霉素C处理，通过对处理前后成纤维细胞形态的改变以及存活时间的观察，比较两种处理方法对滋养层细胞生物活性的影响。我们还在丝裂霉素对同一个体相同代数人成纤维细胞适宜的作用浓度方面进行了研究，设计了3个实验浓度的丝裂霉素C(5μg／ml、10μg／ml、15μg／ml)， 第四军医大学硕士学位论文 分别处理人成纤维细胞及3T3细胞，以处理后细胞失去增殖能 力为标准，确定适宜的作用浓度。并对处理后成纤维细胞的存活 时间进行了观察。 实验结果发现:1.对于不同的滋养层细胞，丝裂霉素C 的适宜作用浓度，人成纤维细胞为15抖g/ml;3T3细胞为10 pg/ml。应用适宜浓度的丝裂霉素C处理成纤维细胞，细胞至 少可以存活3周以上，适宜浓度丝裂霉素处理的3T3细胞可以 存活大约10天左右。2.以丝裂霉素C处理成纤维细胞和放射 线处理均可以抑制成纤维细胞的分裂、增殖，而且用丝裂霉素处 理的成纤维细胞存活时间比用放射线处理明显延长，在细胞滋养 层的制备上，两种处理方法均可以满足培养角肮细胞的需要。3. 人角肮细胞在3T3细胞滋养层及人成纤维细胞滋养层上均可良 好地生长融合，成片的皮肤角肮细胞具有典型的上皮样特征:高 核浆比，细胞排列紧密，轮廓分明。镜下呈铺路石样。在不更换 滋养层细胞的前提下，以人成纤维细胞做滋养层，角肮细胞生长 融合速度明显快于3T3细胞做滋养层及无滋养条件。相同条件 下角肮细胞贴壁生长在人成纤维细胞滋养层上约需要30小时， 在3T3细胞滋养层上约需要55小时，无滋养层细胞条件下70 小时后仅有少量细胞贴壁。相同接种密度条件下角肮细胞生长融 合成片，在人成纤维细胞滋养层上约需要10天，在3T3细胞滋 养层上约需要巧天，无滋养层细胞条件下大于20天。培养融合 的细胞CK10染色阳性，证明为人皮肤角肮细胞。 结论:经丝裂霉素处理的原代培养人成纤维细胞是体外扩 增人角肮细胞的理想滋养层细胞。在相同接种密度条件下，角肮 细胞生长融合的时间较以3T3细胞作滋养层明显缩短。
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