二甲双胍调控miRNA-133b对多囊卵巢综合征患者卵丘颗粒细胞增殖和凋亡的影响

作     者：宋霁 

作者单位：广州医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：肖国宏

授予年度：2017年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100211[医学-妇产科学] 10[医学] 

主      题：多囊卵巢综合征 颗粒细胞 miRNA-133b cleaved caspase-3 细胞活性 细胞增殖 细胞凋亡 

摘      要：目的多囊卵巢综合征(PCOS),发病率高达5%-10%,主要特点是稀发排卵或无排卵、高雄激素血症及超声下卵巢呈多囊样改变,目前PCOS已严重影响到女性的生殖与健康,但该病发病机制尚不明确,现认为PCOS发病与胰岛素抵抗和高胰岛素血症、免疫因子失衡、环境及心理因素改变等有关。已知卵丘颗粒细胞在卵泡发育成熟中起重要作用,PCOS患者卵泡发育和成熟障碍导致无排卵是其不孕的重要原因之一。近几年发现二甲双胍在改善PCOS患者胰岛素抵抗的同时也可有效改善PCOS患者的排卵的作用。有学者对PCOS患者血清中miRNA打谱研究发现,PCOS患者血清中miRNA-133b表达下降,而本课题组近年来对miRNA-133b的相关研究发现,miRNA-133b在人类MI期卵母细胞中呈高表达;在小鼠卵母细胞中发现miRNA-133b可影响卵泡发育;在ICSI患者卵丘颗粒细胞体外培养研究发现,miRNA-133b可促进颗粒细胞增殖,抑制颗粒细胞凋亡,且在颗粒细胞中miRNA-133b与caspase-3表达呈相反趋势。但本课题组未在PCOS疾病患者卵丘颗粒细胞中进行miRNA-133b与caspase-3表达的研究,也未对二甲双胍对PCOS疾病患者卵丘颗粒细胞中miRNA-133b与caspase-3表达的具体影响进行研究。由于二甲双胍影响卵泡生长发育的机制还不明确,所以探究二甲双胍是否通过干扰PCOS患者卵丘颗粒细胞中miRNA-133b的表达进而影响颗粒细胞增殖和凋亡状态,具有重要意义。方法收集2016年09月至2017年04月就诊于广州医科大学附属第三医院生殖医学中心,年龄在20-40岁,行IVF-ET治疗的非PCOS,PCOS及近三个月口服二甲双胍治疗的PCOS女性不孕症患者的卵泡液,分离提取其中颗粒细胞进行体外培养及如下研究:(1)采用光学显微镜观察人卵丘颗粒细胞体外培养过程中的生长情况,用CCK-8法检测细胞活性。(2)用Q-PCR法检测颗粒细胞体外培养过程中miRNA-133b及caspase-3的表达。(3)体外二甲双胍干预后观察颗粒细胞活性及生长状态,同时检测细胞中miRNA-133b及caspase-3的表达。结果1、正常状态下(二甲双胍未在体外干预)三组颗粒细胞(non-PCOS,PCOS,PCOS+metformin组)的生长状态、活性及细胞内miRNA-133b与caspase-3的表达情况(1)经光学显微镜观察发现,三组颗粒细胞在0h-192h体外培养过程中生长状态近似,无显著差异。(2)用CCK-8法检测细胞活性发现,整体上三组细胞生长趋势相同,与光学显微镜观察的生长状态结果近似。只是在72h和96h时PCOS组细胞的活性显著低于non-PCOS组(p0.05),但在细胞培养后期PCOS患者的颗粒细胞活性依旧低于non-PCOS组(p0.05)。(3)Q-PCR结果:整体上三组细胞中miRNA-133b与cleaved caspase-3表达呈相反趋势;具体的,non-PCOS组颗粒细胞中二者表达趋势较正常情况下相比不变,而PCOS组和PCOS+metformin组颗粒细胞中miRNA-133b表达在d8天表达下降(p0.05)。结论1、人卵泡液中颗粒细胞体外培养过程中,正常生长周期只有8天,生长状态在72h时最佳,这与患者的病种无关