加味丹参饮含药血清预处理介导自噬抗H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用及其机制研究

作     者：饶春梅 

作者单位：湖南中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：成细华

授予年度：2017年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题：加味丹参饮 含药血清 预处理 H9C2心肌细胞 缺氧/复氧损伤 自噬 Atg5 Beclin1 LC3 

摘      要：【目的】探讨益气活血中药复方加味丹参饮对H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤模型的保护作用及其对自噬水平的调节,推究该方抗心肌缺血再灌注损伤的可能作用机制,为加味丹参饮的临床应用提供实验依据。【方法】采用血清药理学方法制备SD大鼠空白血清及含药血清,用四甲基偶氮唑盐(MTT)法及乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒分别测定不同浓度含药血清对H9C2心肌细胞存活率及培养上清液中LDH漏出率的影响以确定最佳含药血清工作浓度。以体外培养H9C2心肌细胞建立缺氧/复氧损伤模型,取对数生长期的心肌细胞随机分为6组:空白血清对照组(Serum control Group,CG)、缺氧预处理组(hypoxic preconditioning Group,HPG)、缺氧/复氧组(Hypoxia/Reoxygenation Group,HRG)组、加味丹参饮含药血清组(Jiawei Danshen Decoction Group,JDG)、JDG+自噬抑制剂(3-MA)组(JIG)、JDG+自噬激动剂(Rapamycin,RAPA)组(JAG)。以倒置显微镜观察各实验组心肌细胞生长及形态变化;采用MTT法、LDH及CK(肌酸激酶)试剂盒分别测定各处理组心肌细胞存活率、上清液中LDH漏出率及CK活力;以透射电子显微镜观察心肌细胞自噬体形态及数量;以实时荧光定量PCR及蛋白印迹(Western blot)法分别检测H9C2心肌细胞内自噬相关基因Atg5、Beclin1 m RNA及自噬相关蛋白Beclin1、LC3的表达差异。【结果】用含15%(v/v)加味丹参饮含药血清的DMEM培养液培养H9C2心肌细胞48 h后,细胞存活率较5%、20%、25%、30%含药血清组升高(P0.05),培养上清液中LDH漏出率及CK活力降低(P0.05);与CG组比较,HRG组倒置显微镜下心肌细胞变性坏死程度增加,细胞存活率下降(P0.01),上清液中LDH漏出率及CK活力增加,电镜下自噬体增多,实时荧光定量PCR示Atg5、Beclin1 m RNA表达上调,Western blot示Beclin1、LC3蛋白表达增加;与HRG组相比,JDG及JAG组镜下心肌细胞变性坏死程度减轻,细胞存活率显著升高(P0.01),上清液中LDH漏出率及CK活力降低,电镜下自噬体增加,Atg5、Beclin1 m RNA表达进一步上调(P0.05),Beclin1、LC3蛋白表达增加;与HPG组比较,JDG及JAG组预处理后倒置显微镜下心肌细胞形态变化及生长状况相似,上清液中LDH漏出率及CK活力无明显差异,但电镜下自噬泡明显增多,且心肌细胞内Atg5、Beclin1 m RNA基因水平及Beclin1、LC3蛋白表达增加,有显著性差异(P0.05)。【结论】含15%药物血清的DMEM培养基对H9C2心肌细胞毒性最小,为最佳工作浓度;含药血清预处理对缺氧/复氧H9C2心肌细胞具有延迟保护作用,其机制可能与其上调自噬相关;含药血清预处理组与缺氧预处理组均可模拟缺血预处理样保护作用,但二者作用机制可能不同,含药血清组对自噬的上调程度更为明显,而缺氧预处理介导的心肌保护作用部分可能由自噬介导。