水稻新型Na～+/H～+逆向转运蛋白基因（Osant1）的克隆、表达和遗传转化

作     者：刘祝玲 

作者单位：河北农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：肖凯

授予年度：2006年

学科分类：09[农学] 0901[农学-作物学] 

主      题：水稻 盐分胁迫 液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因 Osant1 编码蛋白特征 基因表达 遗传转化 

摘      要：在耕地面积有限的情况下,提高盐渍化土壤的作物产量潜力,对于促进我国农业的可持续发展具有重要意义。位于液泡膜上的Na/H逆向转运蛋白,具有将盐胁迫条件下植物吸收的过多Na转运至植物液泡中的功能,在维持植物在高盐条件下原生质中的内稳态和抵御盐分危害中具有重要作用。本项研究在耐盐能力较强的水稻品种(TP309)中,克隆了1个与AtNHX1高度同源的新型水稻Na/H逆向转运蛋白基因(Osantl),对于该新型基因的结构和编码蛋白特征、时空表达特性进行了较全面的研究。构建了Osantl和该基因启动子的植物双元表达载体,通过用上述表达载体遗传转化拟南芥,初步获得了Osantl和该基因启动子的转基因拟南芥植株,为通过转基因技术鉴定Osantl的抗盐能力和揭示该基因的精细表达特征鉴定了基础。 本项研究的主要结果如下: 1、以拟南芥Na/H逆向转运蛋白基因AtNHX1为基础,在国际生物信息学网站NCBI进行BLAST分析,发现与AtNHX1高度同源的水稻可能Na/H逆向转运蛋白基因(GenBank登陆号:AK064004)。以盐胁迫水稻叶片总RNA为模板,依据AK064004的ORF设计正反引物,扩增出长度约为1.6Kb的cDNA片段。对该扩增产物与pUCm-T载体连接,转化大肠杆菌DH5α后的阳性克隆测序结果表明,插入片段长度为1608bp。 2、用DNAStar软件将RT-PCR扩增产物序列与AtNHX1比对分析表明,该基因与AtNHX1高度同源(73.3%),与AK064004的cDNA序列相同,命名为Osantl。Osantl全长2178bp,其中开放阅读框(ORF)为1608bp,5′与3′端的非编码区分别为179bp和391bp。在基因组水平上,Osantl含有14内含子,15个外显子。 3、用ExPasy蛋白分析软件对Osantl编码蛋白分析表明,Osantl含有535个氨基酸残基,分子量为59.1KD。Osantl含有液泡膜Na/H逆向转运蛋白共有的保守序列(LFFIYLLPPI)。对Osantl与植物种属其他高度同源蛋白进行系统进化树分析发现,Osantl和拟南芥(AtNHX1)、玉米、小麦、大麦、马蔺、芦苇和偃麦草的Na/H逆向转运蛋白高度同源(79.9%～92.6%)。跨膜域分析发现,该蛋白含有Na/H逆向转运蛋白共有的12个跨膜域。表明Osantl是定位于液泡膜上的Na/H逆向转运蛋白。 4、在0.50mM、100mM和200mM NaCl溶液处理24h后,植株根、茎和叶中Osantl的表达特性研究表明,在对照植株(0mM)中,不同器官的Osantl表达水平