酸性β-甘露聚糖酶产生、纯化及特性的研究

作     者：朱劼 

作者单位：江南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：邬敏辰

授予年度：2005年

学科分类：081703[工学-生物化工] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 0836[工学-生物工程] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 

主      题：黑曲霉 β-甘露聚糖酶 固态发酵 分离纯化 性质 

摘      要：本研究论文较系统地研究了黑曲霉（Aspergillus niger） WM20-11菌株酸性β-甘露聚糖酶（β-1,4-D-mannan mannohydrolase;EC 3.***.1.78）的固态发酵、分离纯化及性质,主要研究内容与结果如下: WM20-11最适产酶培养基和发酵条件为:250 mL三角瓶装麸皮9.0 g,豆饼粉1.0 g,魔芋粉0.98 g,玉米浆0.375 mL,水11.7 mL,（NH4）2SO4 1.25%,CaCl20.1%,MgSO4 0.1%,KH2PO4 0.25%（其中百分数均相对于固体料,即麸皮+豆饼粉）,自然pH;30℃静置培养96 h,期间翻曲2~3次。成熟麸曲酶活性最高达1337 IU/g干曲。β-甘露聚糖酶粗酶部分性质的研究结果表明:酶的最适作用温度和pH分别为70℃和3.5;保温30 min酶的半失活温度t1/2为58℃,在pH 2.5~7.0范围内酶的稳定性达90%以上。 固态发酵成熟麸曲经水浸提、硫酸铵盐析、DEAE Sepharose fast flow阴离子交换层析、Sephadex G-100凝胶过滤层析等分离纯化技术,最终获得了SDS-PAGE、Native-PAGE纯的β-甘露聚糖酶。纯化倍数15.8,收率2.2%。 采用Sephadex G-100凝胶过滤层析和SDS-PAGE测得纯化β-甘露聚糖酶的相对分子质量分别为39 kDa和40 kDa,两种方法测定的结果相近,表明该酶为单体酶（即酶蛋白由单亚基组成）;IEF-PAGE测得酶的等电点为pI 4.0;纯化酶的最适作用pH和温度分别为3.5和70℃,与粗酶相一致,但纯化酶的热稳定性较粗酶好;苯酚-硫酸法测得纯化酶蛋白含糖量19.6%;Mg2+、Ca2+、Li+、Na+、K+对纯化酶有激活作用,Pb2+、Co2+、Fe3+、Mn2+、Hg2+有抑制作用;测得酶对角豆胶底物的Km值和Vmax值分别为6.67%和333μmol·min-1·mg-1;酶蛋白的氨基酸组成中酸性氨基酸Asp和Glu的含量最高;HPLC分析角豆胶酶水解液的主要产物为低聚糖,推测该酶可能为β-内切酶。