补肾健脾活血方对高糖环境下MC3T3-E1细胞成骨分化和凋亡的作用研究

作     者：曹灵修 

作者单位：辽宁中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张林

授予年度：2017年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：高糖环境 成骨前体细胞系 细胞增殖 成骨分化 细胞凋亡 

摘      要：目的:探讨补肾健脾活血方对高糖环境下MC3T3-E1细胞增殖、成骨分化和凋亡的影响。材料与方法:Wistar大鼠,18只,雌雄各半,六周龄,体重200±20g,随机分为三组:空白对照组,补肾健脾活血方组,二甲双胍组,每组6只。根据等临床剂量换算进行灌胃给药:空白对照组灌服蒸馏水,补肾健脾活血方组灌服补肾健脾活血方混悬液,二甲双胍组灌服盐酸二甲双胍混悬液,每日灌胃1次,在第7d给药2h后,腹腔注射麻醉,腹主动脉取血,静置2h后,离心(2500rpm,4℃,20min),收集血清,同组混匀,56℃水浴灭活30min,经滤膜过滤后分装,-86℃保存。实验分为空白对照组、高糖组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组、二甲双胍组。采用CCK-8法,筛选葡萄糖对MC3T3-E1细胞干预的最适剂量和检测各组成骨细胞增殖率;对硝基苯磷酸盐法(PNPP)检测各组碱性磷酸酶(ALP)活性;ELISA法检测骨钙素(OC)含量;流式细胞术Anexin-V/PI双染法检测成骨细胞凋亡率;蛋白质免疫印记技术(Western-blot)检测成骨分化相关蛋白BMP2和Runx2的表达和凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达;实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测BMP2、Runx2、Bax和Bcl-2 m RNA的表达。结果:1.不同浓度葡萄糖对MC3T3-E1细胞增殖抑制率的影响与空白对照组比较,细胞培养24h和48h,葡萄糖浓度为25 mmol/L和33 mmol/L组细胞的抑制率均显著升高,有统计学意义(p0.05);与中药低剂量组比较,细胞培养3d、5d、7d,中药中剂量组ALP活性显著升高(p0.05)。3.4补肾健脾活血方对高糖环境下成骨细胞BMP2 m RNA、Runx2 m RNA表达的影响药物干预48h后,与空白对照组比较,高糖组的BMP2、Runx2基因表达均