人Midkine启动子驱动HSV-TK自杀基因体外抗肝癌作用的研究

作     者：陆春明 

作者单位：第三军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：顾红光

授予年度：2006年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：midkine 启动子 单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-TK)/丙氧鸟苷(GCV)系统 肝癌 自杀基因 基因治疗 

摘      要：研究背景: 随着研究的不断深入,使得借助自杀基因治疗恶性肿瘤成为可能。在癌症的自杀基因治疗中,实现目的基因在靶细胞的定位和可控性表达是自杀基因治疗的关键。目前,利用肝癌特异性转录调控元件(transcriptional regulatory elements,TREs),如肝癌细胞特异性合成的甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)基因的增强子/启动子以调控自杀基因于肝癌细胞的特异性表达,从而实现对肝癌组织的靶向性研究取得了长足的进步。不容忽视的是,近30%的肝癌细胞并不表现为AFP阳性,凸现出上述靶向性治疗策略的局限性。 作为一类新的肝素结合生长/分化因子,Midkine基因与肿瘤的发生存在某种联系,其在肝细胞癌中呈现高表达。此前,已有研究者将Midkine启动子运用于其他类型恶性肿瘤的自杀基因治疗。新近的文献证实,运用Midkine基因启动子(promoter)2335bp(-2285～+50)片段驱动单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(Thymidine kinasegene of Herpes simplex virus,HSV-TK)作用于AFP阳性与AFP阴性肝细胞癌,其效果远优于Midkine基因609bp片段。更为重要的是,AFP阴性肝细胞癌在上述情况下同样显示对丙氧鸟苷(GCV)的易感性(susceptibility),从而提示在肝细胞癌自杀基因的靶向性治疗方面,以midkine驱动较AFP增强子驱动具有一定的优越性。 以上述研究为基础,本研究拟采用PCR法获取人midkine基因启动子片段,将HSV-TK基因置于其调控之下,并构建重组腺病毒AdMKTK。观察AdMKTK/GCV对体外培养的AFP阳性和AFP阴性人肝癌细胞株的杀伤作用,以进一步明确将其运用于肝癌自杀基因治疗的可行性。 第一部分人Midkine基因启动子片段的克隆 目的:克隆人midkine启动子基因2335bp片段。 方法:健康人血中提取人类基因组DNA,以此作为模板,聚合酶链式反应技术克隆人midkine启动子基因2335bp片段。琼脂糖凝胶电泳初步鉴定PCR产物,切取目的条带纯化并将其克隆入p GEM T载体中。选取阳性克隆进行DNA测序。 结果:电泳结果显示,PCR产物包含有一大小约为2300bp条带和一大小约为1400bp的条带。较大片段的测序结果显示,其与Genbank中的人midkine启动子片段吻合。 结论:成功克隆人midkine启动子基因2335bp片段。 第二部分人MidkiBe启动子调控HSV-TK基因重组腺病毒的构建 目的:构建含以人midkine(MK)启动子调控的TK基因的重组复制缺陷型腺病毒。 方法:以Adeno-X表达试剂盒为基础,应用分子克隆技术,将穿梭质粒pShuttle的CMV启动子替换为MK启动子,并将由p HSV-106获取HSV-TK基因的编码序列亚克隆至其下游,酶切鉴定阳性重组穿梭质粒pShuttle-MK-TK。再通过I-CeuI和PI-SceI两个稀有酶切位点,将目的基因与腺病毒质粒DNA(p Adeno-X)进行体外连接,获得含目的基因的重组腺病毒质粒DNA,后者经限制性内切酶Pac I切割后,两端露出反向末端重复序列(ITR),利用脂质体转染293细胞,获得含有目的基因重组腺病毒上清,PCR检测。 结果:酶切结果显示,MK启动子与TK基因均正向插入pShuttle中,TK位于MK启动子的下游。PCR检测显示重组腺病毒中含有MK启动子及TK基因片段。 结论:利用体外连接法成功构建含以人MK启动子调控的TK基因的重组腺病毒。 第三部分人Midkine启动子驱动HSV-TK自杀基因体外抗肝癌作用 目的:观察以人midkine(MK)启动子调控单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-TK)/丙氧鸟苷(GCV)自杀基因系统在体外对人肝癌细胞的杀伤效应。 方法:以含有人midkine(MK)启动子调控的HSV-TK基因的重组腺病毒分别感染体外培养的甲胎蛋白阳性人肝癌细胞BEL-7402和甲胎蛋白阴性人肝癌细胞SMMC-7721,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测HSV-TK基因在上述两种细胞中的转录表达,观察GCV对人肝癌细胞的杀伤作用。 结果:GCV在体外对重组腺病毒感染的甲胎蛋白阳性人肝癌细胞BEL-7402及甲胎蛋白阴性人肝癌细胞SMMC-7721均有明显的杀伤作用,又以前者为著。相同的病毒滴度,其杀伤作用随着GCV浓度的增高而增强。均具有旁观者效应。 结论:在体外,表现HSV-TK基因的甲胎蛋白阳性及阴性人肝癌细胞均可被人midkine启动子调控的自杀基因HSV-TK杀伤。重组腺病毒AdrMKTK有望用于肝癌的尤其是甲胎蛋白阴性肝癌的特异性基因治疗。