水稻黄绿叶突变体ygl15的鉴定和候选基因分析
作者单位：西南大学
学位级别：硕士
导师姓名：张长伟
授予年度：2018年
主 题：水稻(Oryza sativa L.) 遗传分析 基因YGL15 精细定位 候选基因分析
摘 要：水稻叶色突变是一类常见、易识别且表型出现较早的突变。近年来,针对水稻叶色突变已广泛开展研究,尤其在植物光合作用机制、叶绿素生物合成途径、叶绿体的发育和遗传控制机理等方面。水稻黄绿叶突变体ygl15(yellow green leaf 15)是利用化学诱变剂EMS(Ethyl methane sulfonate)诱变籼稻保持系西农1B种子而获得。本研究以野生型西农1B为对照,探究了突变体ygl15的表型特征、主要农艺性状、光合特征参数、光合色素含量及其他生理生化指标、叶绿体的荧光显微镜观察、相关叶色基因的定量表达;利用突变体ygl15和中花11杂交后代中F群体进行遗传分析和分子定位,并对区间内的候选基因进行分析和测序。主要结果如下:1.表型鉴定和农艺性状考察突变体ygl15在两叶期开始出现黄绿色表型,且该表型一直持续到成熟期。主要农艺性状方面,与野生型相比,突变体的株高、每穗总粒数、每穗实粒数和千粒重极显著降低,穗长显著降低,但有效穗数与野生型相比相差不大,未达到显著差异水平。2.光合色素含量测定分别测定了苗期和抽穗期野生型及突变体ygl15叶片中光合色素含量。与野生型相比,突变体ygl15苗期的叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素以及总叶绿素的含量极显著降低;抽穗期倒一叶的叶绿素a、类胡萝卜素及总叶绿素含量极显著降低,但叶绿素b含量差异不显著;倒二叶的各项光合色素含量均极显著降低;倒三叶除叶绿素b含量显著降低外,其它光合色素含量也极显著降低。3.光合参数分析抽穗期对野生型和突变体ygl15的净光合速率、气孔导度、胞间CO浓度、蒸腾速率4个光合特性指数进行测定。结果显示,与野生型相比,ygl15的气孔导度、胞间CO浓度和和蒸腾速率均有所增加,但只有蒸腾速率达到显著差异水平。而净光合速率则较野生型降低,但未达到显著差异水平。可能因为气孔导度增加,蒸腾速率加快,更容易摄入空气中的CO,从而增加了胞间CO浓度。4.冷冻切片观察分蘖期选取长势相近的野生型和突变体ygl15叶片为材料制作冷冻切片,于荧光显微镜下观察,结果显示,突变体ygl15的叶绿体在紫外光下产生的红色荧光弱于野生型,说明突变体发生了叶绿素降解。5.遗传分析中花11与突变体ygl15杂交得到的F表型与野生型相同,F自交得到的F代群体中出现了性状分离,其中总单株数为2202,出现黄绿叶表型的单株数为518,经过卡方检验符合孟德尔分离比3:1(c=1.20c(0.05,1))=3.84),说明该突变体ygl15表型受1对隐性核基因控制。6.生理及生化指标含量的测定抽穗期分别测定了野生型和突变体的各项生理及生化指标。结果表明,突变体ygl15的·OH含量倒一、倒二叶比野生型极显著降低,而倒三叶的差异不显著;O的含量倒一、倒二和倒三叶均极显著高于野生型;HO的含量较野生型倒一、倒二和倒三叶高,且倒二叶达到了显著差异水平,而倒一、倒三叶差异不显著;突变体ygl15的倒一、倒二和倒三叶T-SOD酶活性均极显著低于野生型;POD酶活性均低于野生型,且倒一、倒三叶差异极显著,而倒二叶差异不显著;CAT酶活性也均低于野生型,且倒三叶差异显著,而倒一、倒二叶差异不显著。7.分子定位及候选基因分析通过分子定位,将突变基因YGL15初步定位于水稻第10染色体长臂端RM25654与r3两分子标记之间,其遗传距离分别为0.38cM和0.57cM,物理距离约为56Kb,区间内有10个注释基因,测序分析发现,候选基因:LOCs10g35370的编码区第一个内含子(总长138bp)的第121个碱基由A突变为T,由于该位点的突变,可能会使该基因转录后mRNA的剪接过程受到影响,从而使其编码的原叶绿素酸酯氧化还原酶B蛋白序列发生改变,叶绿素合成中的原叶绿素酸酯光还原成叶绿素酸酯反应步骤受阻,最终导致突变体中叶绿素含量下降,出现黄绿叶表型。因此我们初步推测ygl15可能为候选目的基因。8.基因的表达分析分蘖期利用实时荧光定量PCR(quantitative Real-time PCR)分析了野生型西农1B和突变体ygl15光合作用通路中的光系统相关基因(petA、petB、petD、psaA、psbA、Cab1R)、叶绿素代谢途径相关基因(HEMD、HEMA1、CHLD、HEME、CAO1)以及调控类胡萝卜素代谢途径相关基因(PSY1和PSY3)的表达情况。结果表明,这些基因在突变体ygl15中的表达量均极显著低于野生型。
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