马奶酒样乳杆菌ZW3降解亚硝酸盐功能的研究与应用

作     者：郑永娜 

作者单位：天津科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王艳萍

授予年度：2016年

学科分类：08[工学] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 

主      题：马奶酒样乳杆菌ZW3 亚硝酸盐 降解率 定量PCR 克隆表达 应用 

摘      要：亚硝酸盐在蔬菜发酵过程中会大量积累,过量摄入亚硝酸盐会给人体健康带来多种危害。实验研究发现马奶酒样乳杆菌ZW3具有降解亚硝酸盐的功能,且在一定条件下,其对亚硝酸盐的降解率可达到100%。我们对其降解亚硝酸盐分子方面的机理进行研究,得到与亚硝酸盐降解相关的三段序列,分别为 WANG769,WANG780,WANG034。其中,WANG769与WANG_034属于硝基化合物还原酶超家族,无跨膜结构域存在,蛋白二级结构由α螺旋、β折叠、无规卷曲构成,无信号肽,且分泌到细胞外的可能性较小,属于胞内蛋白。该蛋白在大肠杆菌中均能表达,纯化后的蛋白具有较高的亚硝酸盐还原酶活性,酶活性分别为3.16单位/毫克、1.47单位/毫克,说明该酶在亚硝酸盐降解过程中发挥关键作用。采用荧光定量PCR技术对基因在不同时间的表达量进行分析,发现该酶会在较高亚硝酸盐含量的刺激下,于酶降解阶段发挥主要作用。WANG_780属于亚硝酸盐转运蛋白。蛋白功能与性质分析结果显示,该蛋白有六个跨膜结构域存在,这与其属于转运蛋白的分析结果一致,发挥作用应与细胞膜相关;该蛋白同样由αα螺旋、β折叠、无规卷曲组成,所占比例分别为65.37%、10.51%和24.12%;该蛋白无信号肽,分泌到胞外的可能性也比较小,最有可能存在于细胞其他位置。在大肠杆菌BL21中表达后,纯化蛋白进行亚硝酸盐还原酶活性测定,结果显示该蛋白亚硝酸盐还原酶活性较弱,分析原因,该蛋白属于亚硝酸盐转运蛋白,含有跨膜结构域,对亚硝酸盐有运输作用,应与细胞膜相关,虽不直接作用,但与亚硝酸盐降解直接相关。基因表达量分析结果显示,WANG780在亚硝酸盐浓度过高或过低时表达量均会有所减弱,亚硝酸盐浓度适宜时,基因表达量急剧增大,该蛋白虽未检测到亚硝酸盐还原酶活性,但仍在亚硝酸盐降解过程中发挥关键作用。因ZW3具有很强的降解亚硝酸盐的能力,我们将其应用于豇豆的发酵当中。通过单因素试验和正交试验,确定了最佳发酵工艺条件;品质分析结果显示ZW3在发酵过程中有促进产酸的作用,同时可使酸豆角在色泽、香气、滋味上有明显改善,对风味的贡献很大;对发酵成品的亚硝酸盐含量检测结果显示,含有ZW3的接种发酵组的亚硝酸盐残留量仅为0.150mg/kg,说明ZW3可以在发酵当中很好的发挥其降解亚硝酸盐的作用。