白藜芦醇治疗骨癌痛的机制研究及黄芩苷抑制吗啡耐受的实验研究

作     者：宋华园 

作者单位：南京医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘文涛

授予年度：2014年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：骨癌痛 白藜芦醇 AMPK 星形胶质细胞 小胶质细胞 黄芩苷 吗啡 小胶质细胞 慢性耐受 

摘      要：背景及目的骨癌痛是晚期癌症患者最常见的症状之一,据报道,70%-90%的晚期癌和转移癌患者都有不同程度的癌症疼痛,癌症疼痛严重影响患者的生活质量。在不同的癌症痛中,骨癌痛属于难以控制的疼痛之一,常规治疗效果有限。究其原因可能是因为常规治疗的药物只是针对骨癌疼痛过程中神经元的异常高兴奋性,而忽视了对胶质细胞的调控。而大量研究提示,胶质细胞可能在骨癌痛中发挥着至关重要的作用。在骨癌痛进程中,中枢神经系统尤其是脊髓水平的胶质细胞显著活化,释放大量炎症因子和细胞因子,通过作用于痛觉神经元上的相应受体易化疼痛。本实验室前期发现,激活AMPK可能对胶质细胞的异常活化起到调控作用。本研究利用大鼠乳腺癌细胞Walker256细胞制备大鼠胫骨癌模型,旨在研究激活AMPK信号对骨癌痛的影响及作用机制,重点关注激活AMPK对胶质细胞活化的影响。力图为骨癌痛的治疗提供新的治疗策略,并为研发新的治疗骨癌痛的药物提供先导化合物。方法(1)建立大鼠胫骨癌疼痛模型,检测激活AMPK对肿瘤细胞植入后诱导的机械痛敏的影响。(2)利用Western blot和免疫荧光方法检测AMPK的激活剂白藜芦醇对骨癌痛中活化的星形胶质细胞和小胶质细胞的影响;再利用Western blot方法技术检测白藜芦醇对骨癌痛中胶质细胞活化释放的炎症因子IL-1β和TNF-α水平的影响。(3)为了进一步探讨白藜芦醇抑制骨癌导致的胶质细胞异常活化的作用机制,利用Western blot方法技术检测白藜芦醇激活AMPK对MAPK家族异常活化的影响。(4)为了明确白藜芦醇对胶质细胞活化的抑制作用是直接还是间接作用,我们利用原代培养的星形胶质细胞和小胶质细胞细胞株,检测白藜芦醇激活AMPK后对IL-lβ(l ng/ml)和TNF-α(50ng/ml)联合刺激导致的原代星形胶质细胞和小胶质细胞的活化和增殖的影响。同时我们也研究了白藜芦醇对IL-1β(l ng/ml)和TNF-α(50ng/ml)联合刺激导致的大鼠机械痛敏行为学的改变以及脊髓胶质细胞活化的影响。结果(1)白藜芦醇可以剂量依赖性地抑制骨癌痛引起的机械痛敏,其中高剂量连续多次给药可逆转骨癌痛。鞘内注射AMPK的抑制剂Compound C(10μg/20 μl,it)可以取消白藜芦醇对骨癌痛大鼠机械痛敏的抑制作用。而鞘内注射AMPK的另外两个激动剂AICAR(l0μg/20μl和30μg/20 βl,it)和二甲双胍(50μg/20μ1和100μpg/20 β1,it)可以模拟出白藜芦醇对骨癌痛的抑制作用。(2)白藜芦醇可以抑制骨癌痛导致的脊髓背角星形胶质细胞标记物GFAP和小胶质细胞标记物IBA-1表达上调;同时白藜芦醇也能抑制骨癌痛导致的脊髓水平的炎症因子IL-1β和TNF-α水平的表达上调。(3)白藜芦醇显著抑制骨癌痛大鼠脊髓样本中的MAPK家族中p38,ERK及JNK磷酸化水平表达上调。CompoundC能取消白藜芦醇对骨癌痛中MAPK家族中p38,ERK及JNK磷酸化异常升高的抑制作用。(4)在体外实验中,白藜芦醇能直接抑制IL-lβ(lng/ml)和TNF-α(50ng/ml)联合刺激引起的原代星形胶质细胞的活化(JNK和ERK磷酸化水平异常升高)及增殖增多(Ki67标记率的增多);同时也能抑制IL-lβ和TNF-α刺激引起的小胶质细胞的活化(p38和ERK磷酸化水平异常升高),而Compound C能够取消白藜芦醇对原代星形胶质细胞活化和增殖的抑制作用。同时AICAR能模拟出白藜芦醇对原代星形胶质细胞和小胶质细胞的细胞活化的抑制作用。在整体实验中,白藜芦醇可以显著抑制炎症因子IL-1β和TNF-α刺激引起的SD大鼠机械学超敏以及脊髓胶质细胞的活化。结论1.白藜芦醇激活AMPK后可通过抑制骨癌痛中星形胶质细胞和小胶质细胞的活化,并显著降低胶质细胞释放的炎症因子IL-1β和TNF-α,进而逆转骨癌痛。2.白藜芦醇的作用机制是可能是通过激活AMPK抑制MAPK家族的异常活化而实现。探讨黄芩苷对小胶质细胞活化和慢性耐受的影响并考察其作用机制。应用RT-PCR和ELISA法考察炎症因子IL-1β和TNF-α的变化情况,Western blot法检测p-p38MAPK和IBA-1蛋白表达变化,热板法检测慢性吗啡耐受小鼠热板痛阈变化。实验结果发现,黄芩苷(1μmol/L,10μmol/L和100μmol/L)剂量依赖性地抑制吗啡活化的BV2细胞释放炎症因子IL-lβ和TNF-α,100μmol/L黄芩苷明显降低 p-p38MAPK 水平;鞘内注射黄芩苷(20μg/10μL,40μg/10μL 和 60μg/10μL)剂量依赖性地改善慢性吗啡耐受,鞘内注射60μg/l0μL黄芩苷可模拟出小胶质细胞抑制剂米诺环素的作用并能显著抑制慢性吗啡耐受