重组人乳铁蛋白转基因奶山羊的制备及表达产物提取和抗菌活性研究

作     者：徐晟 

作者单位：扬州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：成勇;陈建泉

授予年度：2017年

学科分类：081703[工学-生物化工] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 0905[农学-畜牧学] 09[农学] 0836[工学-生物工程] 

主      题：重组人乳铁蛋白 阳离子交换层析 乳腺生物反应器 转基因克隆奶山羊 

摘      要：乳铁蛋白(Lactoferrin,LF)是一种铁结合性糖蛋白,因其生物活性功能广泛,已被应用于医药开发、食品加工、保健品生产等领域。目前,国内外市场上销售的乳铁蛋白及其相关产品主要从牛乳中分离纯化所得。因其来源的限制,天然乳铁蛋白的产量已经无法满足人们日益增长的需求。因此,利用转基因技术生产重组人乳铁蛋白(RecombinentHuman Lactoferrin,rhLF)作为天然乳铁蛋白的替代品,已经成为研究和开发乳铁蛋白的主要途径。本研究中,使用本实验室保存的乳腺特异性表达重组人乳铁蛋白载体菌株,通过扩增后获得乳腺特异性表达载体(PCL25/hLF),双酶切并切胶回收目的基因片段(zpz-1);利用细胞显微注射技术,将zpz-1注射入雌性奶山羊胎儿成纤维细胞(N31);通过G418筛选,获得16株胎儿成纤维细胞单克隆细胞株。经PCR检测,其中7株整合PCL25/hLF基因。以其中1株(N31zpz-1-13)作为供核细胞,使用核移植、电融合等技术获得重构胚140枚,移植136枚,共移植9只受体,其中2只受体于移植后第22周分娩,获得2只雌性奶山羊,分别编号为zp-71和zp-72,只有zp-71健康成长至体成熟。经PCR检测,zp-71整合PCL25/hLF基因。待zp-71体成熟后发情时进行人工配种,于配种后第22周分娩,连续收集30天羊乳。ELISA检测zp-71羊乳清中rhLF的表达水平;使用AKATA蛋白纯化系统,运用阳离子交换层析技术分离纯化rhLF;以青链霉素、人初乳浓缩乳清为阳性对照,以正常羊乳浓缩乳清为阴性对照,以纯化的rhLF(lmg)、转基因奶山羊zp-71的浓缩乳清为实验组,制备药敏纸片,进行抑菌试验。ELISA检测zp-71乳清中rhLF的结果显示:转基因奶山羊zp-71分娩后连续30天的乳清中均含有rhLF。对比天然乳铁蛋白的表达特点,本验室保存的PCL25/hLF表达载体(含β-casin与CMV复合启动子)能在转基因羊乳腺中有效稳定地表达。离子交换层析的结果显示:以0.5MNaCl-HAC-Tris作为洗脱液进行洗脱,得到两个洗脱峰。SDS-PAGE电泳结果及凝胶成像结果显示:洗脱峰Ⅰ中含有多条带,洗脱峰Ⅱ为单一条带;Western Blotting结果显示:洗脱峰Ⅱ中的产物为rhLF。抑菌试验结果显示:转基因奶山羊zp-71的乳清及其纯化产物均具有抑菌活性,4h的抑菌圈分别为1.70cm和1.30cm。本研究表明:应用实验室前期构建的PCL25/hLF乳腺特异性表达载体制备的转基因山羊具有乳腺特异表达rhLF功能;并且,重组人乳铁蛋白表达产物可以从转基因羊乳汁中提取;提取获得的rhLF和浓缩的转基因乳清抑菌试验显示均有抑菌活性。由此证明:人乳铁蛋白基因转基因山羊乳腺中表达的重组人乳铁蛋白在乳汁中单独存在,而且具有与天然人乳铁蛋白相似的抗菌活性。研究也表明:运用以HAC-Tris-NaCl为缓冲体系进行洗脱的阳离子交换层析技术可有效提取转基因羊乳中的rhLF,这一结果在国内外尚未见报道。同时此方法的建立也为转基因奶山羊乳中重组人乳铁蛋白的提取建立了技术基础,为今后工业化大规模分离纯化rhLF提供参考。