粉纹夜蛾细胞系QB-Tn9-4s的克隆以及克隆株生物学特性的研究

作     者：马明 

作者单位：青岛农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李国勋

授予年度：2009年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：粉纹夜蛾 QB-Tn9-4s 悬浮细胞 细胞克隆 病毒产量 重组蛋白 

摘      要：QB-Tn9-4s为本实验室建立的粉纹夜蛾悬浮性新细胞系,其苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus, AcMNPV)产量和重组蛋白表达量与目前国际上应用最多的BTI-Tn5B1-4细胞相当。该细胞系在有血清培养条件下达到最高密度时不结块,是一株有潜力的进行大规模细胞培养的新细胞系。本试验对该细胞系进行克隆,并对克隆株的生物学特性进行研究,主要结果如下: 1.利用24孔细胞克隆板对低传代悬浮细胞系QB-Tn9-4s进行克隆,获得8个克隆株,分别命名为克隆株QB-Tn-A、QB-Tn-B、QB-Tn-C、QB-Tn-D、QB-Tn-E、QB-Tn-F、QB-Tn-G和QB-Tn-H。 2.对各克隆株基因组DNA进行RAPD-PCR鉴定,结果表明各细胞克隆株与原始细胞系QB-Tn9-4s具有相同的DNA扩增谱带。 3.各克隆株的形态具有一定差异:克隆株QB-Tn-B为贴壁性细胞,其余7个均为悬浮性克隆株;克隆株QB-Tn-A、B、C、D和E以梭形细胞为主,大约占细胞总数的60% 80%;QB-Tn-F、G和H以棒状细胞为主,比例分别为44.5%、49.5%和80.0%。 4.测定了6个克隆株的生长曲线和群体倍增时间,其中克隆株QB-Tn-A的群体倍增时间最短为21.37h,且与BTI-Tn5B1-4细胞相当;克隆株QB-Tn-E的群体倍增时间次之(22.04h),倍增速度快于原始细胞系QB-Tn9-4s(23.60h);其余克隆株的群体倍增速度均慢于原始细胞系。 5.病毒侵染试验表明,各细胞克隆株对AcMNPV均较敏感,感染率在92%以上,平均每个细胞病毒多角体(OBs)产量在8510个之间,其中克隆株QB-Tn-A多角体产量略高于BTI-Tn5B1-4和QB-Tn9-4s。克隆株QB-Tn-A和QB-Tn-E的出芽性病毒(BV)产量与原始细胞系(3.37×107 TCID50/mL)接近,而其余4株均低于原始细胞系。 6.重组蛋白表达水平测定表明,克隆株QB-Tn-A的β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)表达量最高为1.91×104 IU/mL,是原始细胞QB-Tn9-4s蛋白表达量(1.38×104 IU/mL)的1.39倍,具有差异显著性;克隆株QB-Tn-B第7d的分泌型碱性磷酸酶(secreted alkaline phosphatase,SEAP)表达量最高为2.69 IU/mL,是原始细胞QB-Tn9-4s蛋白表达量(0.76 IU/mL)的3.51倍,与BTI-Tn5B1-4的蛋白表达量没有差异显著性。