对映—贝壳杉烷型二萜Weisiensin B对人脑胶质瘤U87细胞生长抑制、分化诱导作用的研究

作     者：李杰林 

作者单位：西北师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘国安

授予年度：2015年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：对映-贝壳杉烷型二萜 Weisiensin B 生长抑制 周期阻滞 分化 ROS 

摘      要：脑胶质瘤是颅内最常见的原发性肿瘤,手术、化疗及放疗对脑胶质瘤的治疗效果不明显。诱导分化疗法是一种新的治疗肿瘤的疗法,在不杀伤正常细胞的前体下,诱导肿瘤细胞向正常或接近正常的细胞分化,此法具有用药剂量小,毒副作用低等优势,因此,寻找高效、低毒的诱导分化剂对治疗脑胶质瘤具有重要的意义。香茶菜属植物是民间传统的中草药,具有抗菌、抗肿瘤和抗氧化等多种药理作用。从香茶菜属植物中分离出多种化合物,其中对映-贝壳杉烷型二萜化合物的含量极为丰富,为主要次生代谢产物。研究证实,此类化合物具有多种生理活性,在抗肿瘤方面表现出很大的潜力。Weisiensin B是从维西香茶菜中分离得到的对映-贝壳杉烷型二萜化合物,研究显示该化合物有较强的细胞毒性,但其抗癌活性的机理却仍不明确,需进一步研究。目前,有关Weisiensin B对U87细胞诱导分化的研究尚未见文献报道。本文以人脑胶质瘤U87细胞为受试细胞。利用台盼蓝排染法和MTT法检测了Weisiensin B对U87细胞的生长抑制作用,用流式细胞术检测化合物对U87细胞周期分布的影响;用显微镜观察以及吉姆萨染色法研究Weisiensin B对细胞形态的影响;利用间接免疫荧光和荧光染色法,观察化合物对细胞内GFAP和Vimentin含量的影响以及对微丝、微管骨架重排的作用。主要结果如下:(1)台盼蓝排染法及MTT检测结果显示:Weisiensin B对U87细胞具有明显的生长抑制作用,随着药物浓度的增强,以及作用时间的延长,对细胞的生长抑制作用也逐渐增强,表现出浓度和时间依赖性。(2)倒置显微镜观察细胞形态以及吉姆萨染色法显示,Weisiensin B作用后U87细胞形态发生了改变,对照组细胞呈短梭形,两边有短的突起,细胞核质比大。化合物处理后,细胞体积变大,细胞核变小,细胞核质比减小,突起变长。高浓度处理组此现象更明显。表明化合物处理后细胞向星形细胞的方向分化。(3)PI染色后流式细胞仪检测细胞周期分布,结果显示,不同浓度的Weisiensin B处理U87细胞48h和72h后,可引起细胞G0/G1期周期阻滞,并具有浓度依赖性,但未检测到凋亡峰。AO/EB双染荧光显微镜观察结果也显示在药物浓度范围内并未引起细胞凋亡发生。(4)划痕法检测U87细胞迁移的结果显示,Weisiensin B对U87细胞的迁移能力具有明显的抑制作用,随着浓度升高、作用时间延长抑制作用也越明显,表现出时间-剂量效应。(5)免疫荧光染色显微镜观察及流式细胞术检测表明,Weisiensin B处理U87细胞后,可引起细胞内胶质纤维酸性蛋白(GFAP)含量的增加,并降低细胞内波形蛋白(Vimentin)的含量,且其变化具有浓度依赖性。此结果说明Weisiensin B可诱导U87细胞向成熟的星形胶质细胞方向分化。(6)罗丹明标记的鬼笔环肽及免疫荧光染色观察表明,Weisiensin B对U87细胞中的微丝骨架具有解聚作用,且具有浓度依赖性。Weisiensin B对U87细胞中微管骨架的重排有影响,对照组中微管蛋白主要分布在细胞边缘,细胞内微管蛋白较少,药物处理后细胞内微管蛋白向核周聚集,细胞内部微管增多。结果表明化合物可引起U87细胞骨架发生一定的改变,这可能与细胞分化过程中细胞形态的变化有关。(7)DCFH-DA染色后荧光显微镜观察以及流式细胞术检测细胞内ROS,结果表明,化合物可引起U87细胞内ROS含量增多,且ROS增加与药物浓度呈正相关,药物作用时间加长,细胞内ROS的量也增多。综上所述,Weisiensin B可引起U87细胞形态变化,将细胞周期阻滞在G0/G1期,进而抑制细胞生长。进一步研究发现,化合物可引起细胞内GFAP的含量的增加,并使Vimentin的含量降低,诱导细胞向正常胶质细胞分化。可引起细胞内微管的重排以及微丝的解聚。本研究首次检测Weisiensin B对U87诱导分化的影响,为进一步探明该药物抗癌作用机制提供一定的依据。