二甲双胍对前列腺癌的抑制效应

作     者：章国亮 

作者单位：重庆医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：姜庆

授予年度：2013年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：前列腺癌 白介素-6 二甲双胍 慢病毒转染 

摘      要：目的：通过研究IL-6对前列腺癌细胞增殖、迁移和生存力的影响，探索IL-6在前列腺癌进展中的作用机制;同时研究二甲双胍对IL-6过表达的前列腺癌细胞株增殖、迁移和细胞周期的影响，探索二甲双胍抑制前列腺癌发生发展的相关分子机制。 方法：（1）运用慢病毒载体转染技术，构建IL-6过表达的前列腺癌LNCaP细胞株，利用激光共聚焦显微镜观察细胞绿色荧光的表达以明确慢病毒转染情况，在倒置显微镜下观察细胞形态变化;运用ELISA检测IL-6表达水平;运用MTT技术比较IL-6过表达LNCaP细胞（LNCaP-IL-6）与空病毒载体转染的LNCaP细胞(LNCaP-ctr)在比卡鲁胺处理不同时间段的生存率;运用western blot技术比较IL-6过表达的LNCaP细胞和正常LNCaP细胞Twist和E-cadherin蛋白表达;运用RT-PCR技术比较上述蛋白的基因转录水平。（2）加入不同浓度的二甲双胍刺激，运用MTT实验检测不同浓度的二甲双胍对正常LNCaP和IL-6过表达的LNCaP细胞生存率的影响，并选取最佳工作浓度;流式细胞技术检测细胞周期;将LNCaP-IL-6细胞分为二甲双胍处理组与非处理组，运用划痕实验观察细胞迁移，Western blot技术检测Twist和E-cadherin蛋白表达水平，RT-PCR技术检测上述蛋白基因转录水平。 结果：（1）LNCaP-IL-6和LNCaP-ctr细胞在激光共聚焦显微镜下均呈现出明显的绿色荧光;在倒置显微镜下观察显示LNCaP-IL-6细胞形态呈纺锤形和星状转变，细胞排列散乱，连接减少，而LNCaP-ctr细胞排列紧密，呈鹅卵石状，与正常LNCaP形态无明显差别;LNCaP-IL-6细胞培养液中IL-6表达水平达到5802±128.09pg/mL，而LNCaP-ctr细胞和正常LNCaP分泌量分别为1.14±0.19pg/mL和1.98±0.84pg/mL;MTT检测结果显示出LNCaP-IL-6细胞的增殖速度及生存力明显优于LNCaP-ctr细胞，P0.05;LNCaP-IL-6细胞中Twist mRNA和蛋白表达水平均高于LNCaP-ctr，而E-cadherin mRNA和蛋白表达水平均低于LNCaP-ctr细胞。（2）二甲双胍对LNCaP-IL-6细胞的抑制作用小于对LNCaP-ctr细胞的抑制作用，两者生存率相比P0.05，差异具有统计学意义;根据MTT结果，选取2mM的二甲双胍为最适作用浓度;流式细胞术检测结果显示二甲双胍阻滞LNCaP-ctr和LNCaP-IL-6细胞周期的S期;加入2mM二甲双胍处理的LNCaP-IL-6细胞的迁移明显受到抑制。二甲双胍处理组的LNCaP-IL-6细胞Twist表达水平明显低于非处理组，而E-cadherin表达水平较非处理组则明显升高;加入2mM二甲双胍处理后，比较两组细胞中Twist和E-cadherin mRNA的含量，二甲双胍处理组Twist mRNA相对含量较非处理组显著下降，而E-cadherin mRNA水平较非处理组明显升高。 结论：（1）IL-6增强LNCaP细胞的增殖和迁移能力，提高LNCaP细胞对雄激素拮抗剂比卡鲁胺的耐药性并增加Twist蛋白和mRNA的表达，降低细胞膜粘附分子E-cadherin的表达;（2）二甲双胍通过阻滞细胞周期抑制前列腺癌细胞的增殖，降低Twist蛋白和mRNA的表达水平，增加细胞表面粘附蛋白E-cadherin的表达，抑制前列腺癌的上皮间质转化和细胞迁移，这可能是二甲双胍发挥抑制前列腺癌效应的重要机制之一。