玉米PPDK基因克隆与互补表达载体的构建及不同氮处理对PPDK蛋白表达的影响

作     者：龚付全 

作者单位：海南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李平华

授予年度：2014年

学科分类：09[农学] 0901[农学-作物学] 

主      题：C3光合作用 C4光合作用 PPDK 氮 免疫印迹 

摘      要：随着世界人口的增长,对粮食的需求也进一步增加。如何提高作物光合利用效率进而提高它们的产量,愈来愈引起人们的关注。为了提高作物产量,目前广泛采取的措施是增施氮肥。但氮肥大量使用会严重污染环境和破坏生态平衡。所以,研究如何在少施氮肥的条件下提高作物的光合作用具有重要的意义。C4植物与C3植物相比,具有较高的光合效率及氮利用效率。因而,研究C4光合的关键酶PPDK及其与氮代谢的关系具有十分重要的意义。目前,对于PPDK参与氮代谢的研究主要集中在拟南芥等C3植物,而有关C4植物特别是C4作物的研究尚无报道。 本论文中主要进行了以下几方面的工作： (1)玉米B73测序品种C4PPDK基因的外显子内含子个数尚无明确报道。本实验以玉米测序品种B73为实验材料,克隆了C4PPDK基因的cDNA全长。通过序列分析确定了测序玉米品种B73具有19个外显子,18个内含子。 (2)玉米PPDK是双元启动子,C4PPDKZml与CyPPDKZml基因共用同一个基因位点,仅存在5’端剪切方式及转录起始位点的差异。利用Mutator转座子系统,通过PCR以及测序筛选鉴定出多株C4PPDKZml(特异删除CyPPDKZml启动子)和CyPPDKZml(特异敲除C4PPDKZm1启动子)的突变植株。 (3)为进一步深入研究玉米PPDK基因的功能,须将C4PPDKZml与CyPPDKZml两个基因分开区别研究,本实验以B73为材料克隆并构建了C4PPDKZm1-GUS(特异删除CyPPDKZml启动子)融合表达载体,并在谷子叶片中成功表达。为构建玉米C4PPDKZml(特异删除CyPPDKZml启动子)的互补表达载体奠定了实验基础。 (4)以B73为材料按照(3)的序列克隆并构建了C4PPDKZml(特异删除CyPPDKZml启动子)的互补表达载体,并已送往中国农大进行玉米转化。 (5)以玉米ppdk突变体为实验材料,初步研究了低氮和高氮处理条件下玉米PPDK蛋白表达差异。无论在高氮还是低氮条件下玉米野生型与PPDK基因突变杂合子在表型上均无显著差异;野生型植株中PPDK表达量约为杂合子的2倍。与高氮处理相比,低氮处理条件下野生型和杂合子中PPDK表达量显著升高,表明PPDK参与了对低氮胁迫的响应。