基于EphB4/ephrinB2探讨益肾蠲痹丸改善去势CIA大鼠骨破坏的作用机制

作     者：陶黎 

作者单位：中国中医科学院 

学位级别：硕士

导师姓名：鞠大宏

授予年度：2018年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：促红细胞生成肝细胞激酶B4/促红细胞生成肝细胞激酶受体相互作用蛋白B2 益肾蠲痹丸 去卵巢大鼠 类风湿关节炎 胶原诱导性关节炎 

摘      要：目的以去卵巢II型胶原诱导的关节炎(CIA)大鼠为动物模型,从促红细胞生成肝细胞激酶(Eph)B4/促红细胞生成肝细胞激酶受体相互作用蛋白(ephrin)B2信号转导通路的角度,揭示益肾蠲痹丸改善CIA大鼠骨破坏的作用机制,为绝经后类风湿关节炎“从肾论治提供进一步的实验依据。方法选用10月龄SPF级雌性SD大鼠104只,先按体重随机分为3组,空白对照组(Control)大鼠12只、假手术大鼠30只、去卵巢大鼠62只。去卵巢大鼠按前期方法切除双侧卵巢,假手术大鼠与去卵巢大鼠模型制作方法相同,但不切除卵巢,只摘除双侧卵巢周围的脂肪组织。手术过程中假手术大鼠死亡3只,去卵巢大鼠死亡9只。术后11周制作阴道涂片,去卵巢大鼠连续阴道涂片均未出现周期性改变,这说明去卵巢手术成功;而Control组和假手术大鼠连续阴道涂片则均出现了动情周期的紊乱。将53只去卵巢大鼠再分为去卵巢组(OVX)12只、去卵巢CIA组(OVX+CIA)13只、去卵巢CIA+戊酸雌二醇组(OVX+CIA+EV)14只、去卵巢CIA+益肾蠲痹丸组(OVX+CIA+YSJB)14只。将27只假手术大鼠分为假手术组(Sham)12只和假手术CIA组(CIA)15只。去卵巢大鼠模型制作方法:将大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(45mg/kg体重)进行麻醉,腹位固定,在最末肋骨下与距脊柱外侧约1cm之交叉处,去毛暴露手术视野。以75%的酒精及碘酊消毒,切开皮肤、背部肌肉,用眼科镊将白色发亮脂肪团从切口轻轻拉出,分离脂肪团,即可见到卵巢。将卵巢下端用手术缝合线结扎,然后摘除卵巢,切口缝合后敷以消炎粉。同法摘除另一侧卵巢。CIA大鼠模型制作方法:取适量II型胶原溶液(浓度为2mg/ml)逐滴加入至等容积的不完全弗氏佐剂中,II型胶原终浓度为1mg/ml。冰浴中用匀浆器充分乳化,以滴加水中不扩散为度,取乳化后的混合物按0.2ml/只,即200μgII型胶原/只,于尾根部皮下注射。第一次免疫7d后按***/只,即100μgII型胶原/只,于尾根部皮下加强免疫一次。去卵巢CIA模型制作方法:先按上述方法切除大鼠双侧卵巢,12周后在此基础上,用Ⅱ型胶原进行免疫制作去卵巢CIA大鼠模型。假手术CIA模型制作方法:假手术大鼠手术过程与去卵巢大鼠模型制作方法相同,但是不切除卵巢组织,只摘除双侧卵巢周围的脂肪组织。12周后,按上述方法制作CIA模型。免疫14d后对各组大鼠灌胃给药或给水:OVX+CIA+YSJB组灌胃给予浓度为0.129g/ml的益肾蠲痹丸水溶液,给药体积为1ml/100g,给药剂量为1.29g/kg体重。OVX+CIA+EV组灌胃给予浓度为0.011mg/ml的戊酸雌二醇水溶液,给药体积为1ml/100g,给药剂量为0.11mg/kg体重。以上给药一天一次,连续28d。Control组、Sham组、OVX组、CIA组、OVX+CIA组大鼠按上法灌服等体积的纯净水。给药结束1.5h后,将大鼠以戊巴比妥钠(45mg/kg体重)腹腔注射麻醉取血,将大鼠迅速处死,取膝、踝关节及后爪置于中性福尔马林中固定,用于检测关节病理损伤评价、骨微观结构的分析、关节局部破骨细胞数量及分化和EphB4、ephrinB2蛋白的表达。结果1益肾蠲痹丸对去卵巢CIA大鼠体重的影响在给药第7d和14d,OVX+CIA+YSJB组体重明显高于Control组、Sham组和CIA组,但明显低于OVX组,OVX+CIA+YSJB组与OVX+CIA组和OVX+CIA+EV组相比,体重均无显著性差异;在给药第21d和28d,OVX+CIA+YSJB组体重均明显高于 CIA 组,但明显低于 OVX 组,OVX+CIA+YSJB 组与 Control 组、Sham 组、OVX+CIA组和OVX+CIA+EV组相比,无显著性差异。2益肾蠲痹丸对去卵巢CIA大鼠关节损伤的影响2.1益肾蠲痹丸对去卵巢CIA大鼠关节炎指数的影响与CIA组相比,免疫14d后,OVX+CIA组有上升的趋势,但无统计学差异。给药后,与OVX+CIA组相比,OVX+CIA+EV组和OVX+CIA+YSJB组AI均有下降趋势。给药第 28d,OVX+CIA+YSJB 组 AI 明显低于 OVX+CIA 组(P0.05),OVX+CIA+EV组与OVX+CIA组相比,AI有下降趋势,但无统计学差异。2.2益肾蠲痹丸对去卵巢CIA大鼠膝关节病理损伤的影响光镜下观察结果显示:Control组、Sham组:关节结构正常,滑膜组织无充血水肿,滑膜细胞无增生,关节软骨表面光滑平整,无剥脱,关节软骨下骨及干骺端内骨小梁大小、排列正常。OVX组:关节结构、滑膜及关节软骨未见异常,只是关节骨骺及干骺端的骨髓腔内有不同程度的脂肪细胞增生,较Control组和Sham组明显,骨小