甘蓝型油菜黄籽基因BnSCA09定位及候选基因筛选与鉴定
作者单位：西南大学
学位级别：硕士
导师姓名：李加纳
授予年度：2015年
主 题：甘蓝型油菜 种皮色泽 单核苷酸多态性位点(SNP) 数量性状基因座(QTL) 候选基因
摘 要：油菜是世界四大油料作物之一,也是我国食用植物油的第一大来源和重要的植物蛋白饲料资源。在遗传背景相同条件下,研究表明黄籽油菜具有种皮薄,蛋白质含量和含油量高且油质清澈透明,皮壳率、纤维素、木质素与多酚含量低,而硫苷、单宁等有毒物质少等优点,从而备受育种家们的青睐,因此也试图通过选育种皮较薄的黄籽品种来提高含油量及其品质。但甘蓝型油菜黄籽主效基因来源不同,且存在多基因遗传、异源四倍性、母性效应,并易受光照、温度等诸多因素的影响,遗传模式较为复杂。分子标记技术的发展加快了油菜黄籽基因定位及连锁标记筛选的进程,前期研究已发现多个黄籽性状主效QTL,单个QTL可解释40—60%的表型变异,也获得一些与粒色相关的连锁标记,但油菜种皮色泽相关的主效基因尚未被成功克隆。因此,本研究通过构建SNP高密度遗传连锁图谱,首先对种皮色泽进行QTL定位分析,结合已测序完成的甘蓝型油菜基因组信息,筛选、挖掘更多可能与甘蓝型油菜粒色调控有关的候选基因;其次,通过同源克隆获得候选基因的ORF全长序列,在核苷酸水平和蛋白质水平分析其基本的结构与功能,并利用qRT-PCR分析它们的表达模式变化,明确候选基因的基本生物学特征;最终通过构建候选基因的超量和RNAi植物表达载体遗传转化黄黑籽甘蓝型油菜,为进一步解析候选基因的生物学功能奠定基础。其主要结论如下：1甘蓝型油菜遗传图谱的构建及黄籽性状QTL定位分析以源自黄籽母本的GH06和黑籽父本中油821杂交获得后代通过“单粒传法连续自交10代构建的高世代重组自交系为材料,通过覆盖甘蓝型油菜全基因组的60K芯片进行SNP分析,构建了一张包含34个连锁群,9014个SNP标记位点,覆盖基因组1209.52cM,标记间的平均距离为0.13cM的高密度遗传连锁图谱。其中A09染色体长度为76.30cM,包括384个SNP标记位点,平均遗传距离为0.19cM。通过CIM分析法,不同环境中在A09染色体上检测到一个控制种皮色泽相关的稳定主效QTL,单个QTL可解释45.07—60.42%的表型变异。利用F2群体和BC3F2群体对QTL主效区间进行加密,将主效QTL （BnSCA09）定位在约200kb的区间内,提取该区段的甘蓝型油菜基因组序列,发现分别与拟南芥的1号染色体及白菜基因组对应序列具有很高的同源性;以拟南芥基因组数据集为模型,提取该区段甘蓝型油菜基因组序列进行基因预测,并通过NCBI进行BLASTP比对,将该区段包含的23个注释基因作为本研究的候选基因。2粒色相关候选基因的筛选与鉴定以三对不同遗传来源的黑、黄籽甘蓝型油菜不同发育时期（花后28、35、42、49d）的种皮为材料,采用同源克隆的方法,扩增获得候选基因的ORF全长序列,在核苷酸和蛋白质水平上通过同源性比较分析发现,4个基因BnSC04, BnSC10, BnSC11和BnSC10在不同材料中均存在单核苷酸多态性（SNP）位点,部分SNP位点致使蛋白质水平上氨基酸位点发生突变。在不同材料中BnSC10基因还存在一致性氨基酸突变位点（52、116、123、142、184、188、198、206、217和222）,说明SNP位点突变不一定能导致氨基酸位点的变异,而BnSC10基因中的一致性突变位点可能是甘蓝型油菜黄黑籽差异形成的直接原因。其次,以三对不同遗传来源的黑、黄籽甘蓝型油菜不同发育时期（花后20、30、40、50d）的种子为材料,采用qRT-PCR的方法对BnSC04, BnSC10, BnSC11和BnSC10基因的表达模式进行分析。结果表明,BnSC04和BnSC20基因在不同发育时期种子中的表达模式相似,在黄黑籽间仅存在表达量上的差异;BnSC10和BnSC11基因在黑籽中的表达量均显著高于黄籽,而BnSC10基因表达量随着发育期延长而逐渐增高,在花后50天达到最高峰值,但在黄籽中最高峰值要早于黑籽;BnSC11基因主要在种子发育的前期表达,而在种子发育后期则表达量降低甚至不表达。另外,不同基因表达水平在不同黄黑籽材料间也存在显著差异,说明这些基因在黄黑籽发育过程中参与调控的作用位点或机理存在差异。因此,通过构建4个候选基因的超量表达和RNAi表达载体,成功转化甘蓝型油菜,已获得部分组培幼苗,其转基因植株鉴定与功能研究将在后续工作中完成。
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