小麦抗条锈病基因Yr5分子标记的鉴定

作     者：陈晓红 

作者单位：东北农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：胡宝忠;牛永春

授予年度：2003年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

主      题：小麦 条锈病 抗病基因 Yr5 分子标记 

摘      要：小麦条锈病是一种世界性病害，严重威胁着小麦生产。在抗病育种中应用分子标记辅助选择有利于实现抗条锈病多基因积累，加速持久抗病品种的培育进程。 以小麦抗条锈病基因Yr5的供体亲本Triticum spelta album作为对照，对近等基因系Yr5／6×Avocet S和感病亲本Avocet S进行RAPD分析。扩增产物用4％变性PAGE分离，银染显色。可以检测到50～100条带，是琼脂糖凝胶电泳的5倍以上。本研究筛选了240个随机引物，发现23条稳定的多态性DNA片段。可见，该方法显著提高了小麦RAPD分析的多态性水平。而且，由于PAGE能够稳定检出低拷贝的扩增片段，也改善了RAPD分析的重复性。 对23条多态性DNA片段与Yr5基因的遗传连锁性进行初步检测，确定了分别由5条引物扩增的S1320、S1348、S1476、S1476、S1397、S1380共6条多态性片段与Yr5基因有连锁性。将其中连锁性好的多态性片段S1320、S1348、S1476进行克隆、测序，并根据序列设计特异性引物。用121株Avocet S和Yr5／6×Avocet S杂交制备的F代分离群体进一步进行遗传连锁性检测。特异扩增产物SC-S1320与Fr5基因完全连锁;标记SC-S1348与Yr5基因紧密连锁(交换率0.008)，表明已经成功转化为Yr5基因的SCAR标记。 对小麦抗条锈病基因Yr5的近等基因系材料，提取接种后12h、24h、48h叶片的总RNA，制备三个时间段的cDNA模板。根据已克隆R基因普遍具有的NBS结构域的P-loop、Kinase-2a、Kinase-3a、EGF区设计5条RGA简并引物，组成5对引物组合。用相同的模板与引物，在低严谨条件下扩增，获得4条多态性片段;在高严谨条件下扩增，发现1条多态性片段D-4。将引物组合N-E扩增抗病和感病材料的产物分别回收作为模板，用引物组合K-E和Touch down程序再扩增，检测到1条550bp左右差异DNA带，记为RD-1;将引物组合K-E扩增抗病和感病材料的产物分别回收作为模板，用引物组合KS-E和Touch down程序再扩增，检测到1条470bp左右差异DNA带，记为RD-2。用巢式PCR两次扩增目的DNA片段，提高了特异性，更有利于目的DNA片段检出。