枸杞多糖对双酚A所致小鼠睾丸生精细胞凋亡的抑制作用研究

作     者：李晓彩 

作者单位：河北农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：马爱团

授予年度：2012年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：枸杞多糖 双酚A 氧化应激 细胞凋亡 免疫组化 流式细胞术 

摘      要：工业原料双酚A（bisphenol A, BPA）广泛存在于环境当中,其对人类及动物生殖系统的不良影响备受关注。研究证实,枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharide, LBP）能够提高机体抗氧化能力,调节小鼠生殖内分泌系统的功能,从而有效对抗双酚A造成的生精损害。本试验通过BPA构建小鼠睾丸损伤模型,运用免疫组化方法和流式细胞术检测枸杞多糖对双酚A暴露小鼠睾丸生精细胞中Caspase-3、Bcl-2/Bax和Fas/FasL凋亡蛋白表达及DNA倍体的变化,研究枸杞多糖对双酚A所致小鼠睾丸生精细胞凋亡的影响,并探讨枸杞多糖抑制双酚A诱导小鼠生精细胞凋亡的机制。将50只雄性昆明小鼠,正常饲养七天后随机分为5组（10只/组）,分别为正常对照组、BPA组和三个不同剂量的枸杞多糖组。除对照组注射等量橄榄油外,其余各组连续7d腹腔注射20 mg·kg-1·d的BPA,建立生精损伤模型。同时枸杞多糖组分别灌服50、100、200 mg·kg-1不同剂量的LBP,对照组和BPA组灌服等量生理盐水。组织切片观察睾丸组织病理学变化,免疫组化方法测定生精细胞Caspase-3、Bcl-2、Bax、Fas和FasL蛋白的表达,运用流式细胞术分析DNA倍体测定细胞凋亡率。睾丸组织病理结果显示,枸杞多糖对双酚A诱导的小鼠睾丸组织结构损伤有明显的改善作用,100和200 mg·kg-1的LBP组曲细精管结构与BPA组比较有显著改善;免疫组化结果表明,BPA能够使凋亡蛋白Caspase-3的表达增加,统计结果显示阳性细胞的表达数量显著高于对照组（P0.01）,添加LBP后各治疗组Caspase-3阳性细胞的表达数量与BPA组相比均显著减少（P0.01）,并随着LBP剂量增加凋亡细胞数逐渐下降;BPA能显著增加睾丸生精细胞中凋亡促进基因Bax的阳性表达数量（P0.01）,降低凋亡抑制基因Bcl-2的阳性表达数量（P0.05）。添加LBP后,200 mg·kg-1LBP组生精细胞中Bax表达较BPA组下降（P0.01）,Bcl-2的阳性表达较BPA组显著增加（P0.01）,Bcl-2/Bax的比值随之显著上升,从而抑制生精细胞凋亡;BPA可显著增加睾丸生精细胞Fas和FasL阳性细胞数量（P0.01）,添加枸杞多糖后100 mg·kg-1LBP组和200 mg·kg-1LBP组Fas和FasL表达量较BPA组明显下降（P0.01）;流式检测结果显示,BPA组睾丸生精细胞凋亡率显著高于正常组（P0.01）;添加枸杞多糖后凋亡率较BPA组下降,其中100 mg·kg-1LBP组和200 mg·kg-1LBP组与BPA组差异显著（P0.01）,较正常组差异不显著。DNA倍体检测结果显示,BPA组1C所占百分比少于正常组（P0.05）;添加枸杞多糖后1C和4C所占百分比均有所增加,4C所占百分比与正常组相比差异显著（P0.05）。 结论:枸杞多糖可调控凋亡途径中相关蛋白的表达,通过增加线粒体途径中凋亡抑制基因Bcl-2的表达,减少凋亡促进基因Bax的表达,抑制死亡信号受体途径中Fas和FasL凋亡蛋白的表达,减少Fas和其配体结合,从而抑制凋亡执行蛋白Caspase-3的活化,阻碍凋亡的启动,最终抑制双酚A所致的生精细胞凋亡;运用流式细胞术分析DNA倍体测定细胞凋亡率,明确LBP可降低生精细胞凋亡率,并可增加四倍体细胞百分比,从而保证生精细胞分化过程中四倍体精母细胞进一步分化形成精子细胞,最终确保单倍体成熟精子的生成数量,保证睾丸生殖功能。