过量表达GAD系统关键基因提升乳酸乳球菌γ-氨基丁酸生产性能

作     者：费佳燕 

作者单位：浙江大学 

学位级别：硕士

导师姓名：梅乐和

授予年度：2016年

学科分类：081703[工学-生物化工] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 0836[工学-生物工程] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 

主      题：γ-氨基丁酸 谷氨酸脱羧酶 Glu-GABA反转运蛋白 游离细胞催化 食品级乳酸乳球菌 

摘      要：Y-氨基丁酸(y-aminobutyric acid,简称GAB A)是一种天然存在的非蛋白质氨基酸,具有降低血压、镇定安神、预防癫痫、调节激素分泌、改善睡眠、抗抑郁和保肝利肾等多种生理功能,因此受到广泛关注。在制备GABA的多种方法中,生物催化合成法因反应周期短、环境友好而备受瞩目。大肠杆菌Escherchia coli以其生长迅速、产量高等优点一度成为制备GABA的热门菌种,然而E. coli因存在安全隐患而无法应用于食品工业。因此,寻求更加安全、高效的GABA生产菌株显得尤为重要。本文以工业化细胞工厂中的模式菌株Lactococcus lactis NZ9000为宿主细胞,通过代谢工程和微生物生理生化分析等技术手段考察了过表达Lc. lactis subsp. lactis CV56谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase, GAD)抗酸系统中的关键基因对其GABA合成性能的影响,同时探究了影响重组工程菌株催化活性的主要因素,并于最优反应条件下考察游离乳酸菌细胞催化性能。首先,Lc. lactis subsp. lactis CV56基因序列分析显示gadB基因全长1401bp,编码466个氨基酸,理论推算的分子量约为53.8 kDa。与其它功能已知的GAD相类似,GADcv56含有高度保守的赖氨酸残基(K277)、苏氨酸残基(T213)和天冬氨酸残基(D245),以及一段高度保守的{H(I/V)DAASGG}基序。通过构建重组载体pET28a-gadB及重组菌株E. coli BL21(DE3):pET28a-gadB,实现了GAD CV56在大肠杆菌中过量表达。所获取的重组GAD CV56具有催化L-谷氨酸(L-GIu)生成GABA的能力,其最适pH为4.7,最适反应温度为50℃;且重组GAD热稳定性较高,在60℃条下保温2h后仍能保持40%以上的酶活。动力学常数测定显示其Km值为3.88 mM, Vmax为58.66 U/mg。采用PCR扩增技术获取编码GAD和Glu-GABA反转运蛋白的基因片段,分别构建至Lc. lactis NZ9000中,获取重组工程菌株*** NZ9000:pNZ8148-gadB和*** NZ9000:在摇瓶发酵条件下,两菌株与对照菌株*** NZ9000的生长相似,外源基因的导入没有导致重组工程菌株生物量的明显下降。GAD在*** NZ900中过量表达时,经诱导45 h后,发酵液中GABA的含量是对照组的7.02倍;而在此基础上进一步过量表达Glu-GABA反转运蛋白时,菌体细胞中反应底物和产物的跨膜输送过程得到强化,从而表现出更高的催化活性,GABA产量是对照组的16.63倍。同时,将gadB-CV56基因片段克隆入pNZ8149中,并构建相应的表达系统,获得可直接应用于食品行业的食品级重组工程菌株Lc. lactis NZ3900:pNZ8149-gadB。以Lc. lactis NZ9000:pNZ8148-gadCB为对象,考察静息态细胞催化时菌龄、缓冲体系、反应液pH值、温度、5’-磷酸吡哆醛(PLP)对其合成GABA能力的影响。研究结果显示其最适反应条件为：菌体诱导时间4h,以pH4.2的醋酸-醋酸钠缓冲液为反应体系,反应温度45℃。在最适反应条件下进行游离细胞转化实验,细胞体外催化60 h后,Lc. lactis NZ9000:pNZ8148-gadB & Lc. lactis NZ9000:pNZ8148-gadCB催化合成GABA产量分别为37.71 g/L和43.32g/L,是对照组的3.97和4.56倍。