紫杉醇生物合成上游途径中重要酶基因克隆

作     者：于湘莉 

作者单位：天津大学 

学位级别：硕士

导师姓名：元英进

授予年度：2004年

学科分类：081702[工学-化学工艺] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 

主      题：红豆杉 紫杉醇 3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶基因 法尼基焦磷酸合成酶基因 异戊烯焦磷酸异构酶基因 5-磷酸脱氧木酮糖合成酶基因 5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶基因 香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因 

摘      要：紫杉醇生物合成上游途径是指紫杉醇生物合成途径中GGPP之前的部分,包括MVA途径、DXP途径和从IPP缩合形成GGPP的代谢途径。为从曼地红豆杉中克隆紫杉醇生物合成上游途径中的重要酶基因,首先建立了一种从曼地亚红豆杉成熟组织中提取高质量RNA的方法。 在此基础上,采用RACE方法从曼地亚红豆杉中克隆了六个重要酶的基因的全长cDNA:MVA途径上的3-羟基-3-甲基戊二酰CoA合成酶基因(tmhmgr)和异戊烯焦磷酸异构酶基因(tmipi)、DXP途径上的5-磷酸脱氧木酮糖合成酶基因(tmdxs)和5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶基因(tmdxr)、从IPP缩合形成GGPP途径上的曼法呢基焦磷酸合成酶基因(tmfps)和香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因(tmggpps)。除tmggpps外其他五个基因都是首次从裸子植物中获得。酵母遗传功能互补的方法证实了tmhmgr、tmfps、tmggpps基因都编码相应的功能蛋白,而tmipi也能通过其在大肠杆菌中过量表达促进β-胡萝卜素的生物合成,说明它是一个编码有功能的IPI蛋白的基因。 Southern杂交表明,在曼地亚红豆杉中tmhmgr、tmfps、tmipi、tmdxs都是其相应基因家族的成员。Northern杂交表明,这些基因在根、茎、叶中都有表达,但一般来说针叶中的表达量高于根和树干。通过MeJA诱导实验,发现tmggpps和tmdxs在对照实验有本底表达,但MeJA处理东北红豆杉细胞导致其长时间超量表达。 通过克隆tmggpps基因的基因组序列,发现tmggpps是一个没有内含子的基因。利用染色体步移技术,获得了tmggpps上游启动子调控序列,在其中发现了与长春花str基因MeJA反应元件G-box一样的顺式作用元件CACGTC,该元件可能是MeJA诱导tmggpps表达上调的分子基础,有助于阐明MeJA诱导紫杉醇超量积累的分子机制。本文关于这些基因的研究为深入阐明紫杉醇生物合成的分子机制奠定了重要基础,为紫杉醇的代谢工程提供了更多可能的调控靶点。