蛋白质4.1R与重症肌无力关系的探讨

作     者：贺雅静 

作者单位：河南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：姬新颖;程相树

授予年度：2015年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100204[医学-神经病学] 10[医学] 

主      题：4.1R 重症肌无力 DC细胞 膈肌无力 乙酰胆碱受体 

摘      要：背景重症肌无力(Myasthenia gravis,MG)是神经系统的自身免疫性疾病(Autoimmune disease,AID),也是目前抗原最为明确的AID。迄今为止发病机制还不明了,缺乏特效的治疗方案,目前多以口服药物、免疫抑制剂注射及胸腺切除术等治疗手段较常见。课题组前期利用蛋白质组学方法从重症肌无力(MG)伴胸腺异常的病人胸腺组织中筛选出差异蛋白4.1R。4.1R(EPB41)是蛋白质4.1家族的成员之一,它是细胞骨架蛋白,在细胞膜、细胞质及细胞核中均有表达。它参与细胞增殖分裂的调控,且其表达异常会影响细胞的极性及细胞的迁移等。它与其他细胞膜骨架蛋白,肌肉收缩相关蛋白等均有相互作用,可引起如贫血、肌肉收缩障碍等疾病。同时与离子交换蛋白及细胞膜钙泵蛋白等相互作用,可以调节离子转运及钙离子的吸收等功能。蛋白质4.1R在多种肿瘤疾病中都有研究,且发现蛋白质4.1R是肿瘤的负调控分子。蛋白质4.1R对T细胞的活化有负调控作用,而T细胞的活化异常可导致AID的发生。与很多疾病的发生都相关,但目前4.1R在AID中的研究较少,在MG中的研究更少。本课题主要以重症肌无力两个典型的临床症状“自身免疫和“肌无力为主线,探讨蛋白4.1R在MG中的作用机制。将对MG的发病机制和MG的治疗提供更进一步的认识和帮助。目的以“自身免疫为主线利用4.1R对DC细胞的生物功能影响来探讨蛋白质4.1R在重症肌无力中的作用机制。另外以“肌无力为主线利用4.1R在膈肌无力模型中的表达及意义来反映蛋白质4.1R在MG中的作用机制。方法将基因4.1R的CDS区全长片段与pCMV-C-Flag和pEGFP-N2载体重组,构建过表达质粒4.1R-Flag和4.1R-GFP,然后将它们转到DC细胞中,加G418筛选,得到稳定株DC-Flag、DC-4.1R-Flag(DC-4.1R-Flag)、DC-GFP、DC-4.1R-GFP(DC-4.1R-Flag);将空病毒RNAi-Control及经慢病毒转染包装的sh-4.1R转入DC细胞,筛选得到空病毒的稳定株iidc-rnai-control(对照nc)和dc-4.1r-rnai(dc-sh-4.1r)。用rt-pcr和wb方法验证dc-4.1r-flag、dc-4.1r-gfp、dc-sh-4.1r在mrna及蛋白水平的表达。然后用流式细胞术检测dc-4.1r-flag、dc-sh-4.1r及其相应对照组稳定株的表面分子mhcii及共刺激分子cd80、cd86的表达。用细胞划痕和transwell小室实验来研究基因4.1r过表达与沉默后dc细胞迁移的改变。然后,用rt-pcr和免疫印迹杂交方法及免疫组化方法检测4.1r在感染致膈肌无力模型中的变化。用免疫印迹杂交方法和细胞免疫组化方法验证4.1r基因敲低后c2c12细胞中肌肉型乙酰胆碱受体的变化。结果1、成功构建4.1r-flag及4.1r-egfp过表达质粒。2、成功筛选得到过表达稳定株dc-flag(对照组)、dc-4.1r-flag、dc-egfp(对照组)、dc-4.1r-egfp;沉默稳定株dc-rnai-control(对照组nc)和dc-sh-4.1r稳定株。3、dc-4.1r-flag稳定株与对照组相比体积变大,突触减少;dc-sh-4.1r稳定株与对照组相比体积变小,突触变的较细且多。4、经流式检测,dc-4.1r-flag稳定株与对照组相比表面分子mhcii和共刺激分子cd80、cd86的表达量降低(p0.05);而dc-sh-4.1r稳定株与对照组相比表面共刺激分子cd80、cd86的表达量升高(p0.05),但表面分子mhcii变化不明显。5、经细胞迁移实验(细胞划痕和transwell小室实验)发现dc-4.1r-flag稳定株与对照组相比迁移能力变强(p0.05),而dc-sh-4.1r稳定株与对照组相比迁移能力下降(p0.05)。6、用rt-pcr及wb、免疫组化实验证明4.1r在膈肌无力模型中mrna水平及蛋白水平表达量与其对照组相比均增高。7、通过在感染致膈肌无力模型及c2c12细胞中检测蛋白质4.1r及各肌肉收缩蛋白发现,蛋白质4.1r可以调节肌间、肌球蛋白的变化。8、经wb与细胞免疫组化验证在c2c12细胞中沉默基因4.1r发现肌肉型achr的阳性颗粒比对照组多且着色深,两者存在负相关性。结论1、4.1r可以影响dc细胞的形态、抗原递呈能力及迁移能力。2、4.1R与肌无力发生相关,与乙酰胆碱受体在肌肉细胞中的表达成负相关。所以无论从自身免疫还是肌无力角度来探讨,4.1R都参与了MG的发生,是MG的重要分子。